NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화
Summary
여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 DNA와 과립 유래 항균 단백질로 구성된 웹과 같은 항균 구조입니다. 면역형광 현미경 검사법 및 이미지 기반 정량화 방법은 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하는 중요한 도구로 남아 있습니다. 그러나, 현재 NET를 정량화하기 위해 이용 가능한 면역형광 기반 방법에 대한 주요 제한사항이 있다. 이미지 기반 NET 정량화의 수동 방법은 종종 주관적이며 오류가 발생하기 쉽고 사용자, 특히 경험이 없는 사용자에게는 지루합니다. 또한 현재 사용 가능한 정량화 소프트웨어 옵션은 반자동이거나 작동 전에 교육이 필요합니다. 여기서, 우리는 NETQUANT라고 불리는 NET 형성을 평가하기 위해 자동화된 면역형광 기반 이미지 정량화 방법의 구현을 입증한다. 이 소프트웨어는 사용하기 쉽고 사용자 친화적 인 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 가지고 있습니다. 그것은 표면적 및 DNA의 증가와 같은 생물학적으로 관련된 매개 변수를 고려합니다: NET 마커 단백질 비율 및 핵 변형은 NET 형성을 정의합니다. 또한,이 도구는 자유롭게 사용할 수있는 응용 프로그램과 함께 내장되어 있으며, 단일 셀 해상도 정량화 및 분석을 할 수 있습니다.
Introduction
호중구는 다양한 미생물 병원균에 대한 선천적 숙주 방어 반응의 중요한중재자1. 그들은 항균 단백질2의넓은 배열을 포함하는 그들의 과립을 풀어 놓음으로써 그들의 항균 기능을 실행합니다 2, 반응성 산소 종 (ROS) 및 hypochlorite1을일으키고, 식세포증3를통해. 또한, 브링크만 외. 4 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 호중구가 침입 병원체를 트랩하고 제거하는 새로운 메커니즘으로 기술했습니다. 그들의 발견 이십 년 전 조금 10 년 전부터 4,NETs는 감염성5,6 및 비 감염성7 이환의 다양한에서 연루되었습니다. NET 형성은 과립 유래 항균 단백질로 코팅된 염색질 DNA의 압출을 초래하는 활성 과정 및8. NET 형성과 관련된 세포 및 핵 형태학의 주요 변화 중 일부는 핵 형태, 크로마틴 데톤 덴션의 손실, 세포질에서 핵으로의 과립 단백질의 동원 및 핵 및 세포 직경의 증가를 포함한다8,9.
상기 웹형 NET는 세포보다 약간 큰 확산 구조또는 단일 호중구보다 몇 배 더 큰 구조로서 나타날 수 있는 NETosis5,10의지표로 간주된다. 형광 현미경 검사법을 사용하여, NET는 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 같은 형광 프로브로 DNA를 조사하고 호중구 엘라스타아제와 같은 순 결합 단백질에 대한 면역 형광 염색에 의해 검출될 수 있습니다. DNA 및 NET 결합 단백질에 대한 염색의 중첩 영역의 정량화는 이미지11에서NETs 아래의 전체 영역을 결정한다.
다양한 이미지 분석 옵션을 사용하여NET1,12의형광 이미지 기반 정량화를 수행할 수 있습니다. 그러나 이러한 소프트웨어 옵션은 사용자 친화적이거나 완전히 자동화되지 않는 데 한계가 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 NETQUANT13의작동을 보여줍니다, 편견 완전 자동화 된 면역 형광 현미경 현미경 이미지 기반 의 NET 정량화를 수행 할 수있는 자유롭게 사용할 수있는 응용 프로그램. 이 앱은 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스(GUI)를 가지며 단일 셀 분석을 수행할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 DNA-NET 결합 마커, 염색질 데톤 데톤 형성 관련 변형 및 DNA의 증가:NET 결합 단백질 비율의 영역에서 형태학적 변화를 검출함으로써 이미지에서 NETosis를 정량화합니다. 종합하면 여러 NET 정의 기준을 통해 여러 데이터 세트에 대해 공정한 방식으로 엄격한 NET 정량화를 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET 형성은 다양한 호중구 armamentarium4에 비교적 최근에 첨가되어 있으며 광범위한 연구 영역5,7,14,15에서NET의 의미를 연구하는 데 관심이 눈에 띄게 급증하고 있다. 면역형 광현미경 검사법 및 후속 이미지 기반 정량화를 사용하여 이미지를 획득하는 것은 NET를 정량화하는 데 널리 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Crafoord 재단 (TM 및 PN), 스웨덴 정부 연구 보조금 (PN, TM), 스웨덴 연구 위원회 (PN) 및 그로신스키 재단 (TM, PN)에 의해 지원되었다.
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
