Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.
Abstract
As armadilhas extracelulares neutrófilas (NETs) são estruturas antimicrobianas semelhantes à teia, consistindo de proteínas antimicrobianas derivadas de DNA e grânulo. A microscopia de imunofluorescência e os métodos de quantificação à base de imagem continuam a ser ferramentas importantes para quantitar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. No entanto, existem limitações fundamentais para os métodos baseados em imunofluorescência que estão atualmente disponíveis para quantificar NETs. Métodos manuais de quantificação NET baseada em imagem são muitas vezes subjetivos, propensos a erros e tediosos para os usuários, especialmente usuários não experientes. Além disso, as opções de software atualmente disponíveis para quantificação são semi-automáticas ou exigem treinamento antes da operação. Aqui, demonstramos a implementação de um método automatizado de quantificação de imagem baseado em imunofluorescência para avaliar a formação NET chamada NETQUANT. O software é fácil de usar e tem uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável ao usuário. Considera parâmetros biologicamente relevantes, como um aumento na área de superfície e dna:net marcador proteína razão, e deformação nuclear para definir a formação NET. Além disso, esta ferramenta é construída como um aplicativo disponível gratuitamente e permite a quantificação e análise de resolução de células únicas.
Introduction
Neutrófilos são mediadores cruciais de respostas inatas de defesa do hospedeiro contra uma grande variedade de patógenos microbianos1. Eles executam suas funções antimicrobianas liberando seus grânulos contendo uma grande variedade de proteínas antimicrobianas2,produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e hipoclorite1,e através da fagocitose3. Além disso, Brinkmann et al. 4 descreveram armadilhas extracelulares neutantes (NETs) como um novo mecanismo pelo qual os neutrófilos prendem e eliminam patógenos invasores. Desde a sua descoberta há pouco mais de umadécada,os NETs têm sido implicados numa grande variedade de5,6 e7 morbidadesnãoinfecciosas. A formação líquida é um processo ativo e resulta na extrusão do DNA de cromatina revestido com proteínas antimicrobianas derivadas de grânulo8. Algumas das principais mudanças na morfologia celular e nuclear associadas à formação net incluem a perda de morfologia nuclear, decondensation cromatina, mobilização de proteínas de granule do citoplasma para o núcleo e um aumento no diâmetro nuclear e celular8,9.
Os NETs semelhantes à web, que podem aparecer como estruturas difusas ligeiramente maiores do que a célula ou como estruturas várias vezes maiores do que um único neutrófilo são considerados como indicadores de NETosis5,10. Usando microscopia de fluorescência, nets podem ser detectados por sondagem de DNA com uma sonda fluorescente, como 4′,6-diamidino-2-fenilatoladole (DAPI) e por imunofluorescência manchando contra net-bound proteínas como neutrophil elastase. Quantificação de áreas sobrepostas de coloração para DNA e proteínas net-bound determina a área total NETs em uma imagem11.
Uma série de opções de análise de imagem estão disponíveis para realizar quantificação baseada em imagem de fluorescência de NETs11,12. Mas essas opções de software apresentam limitações em não ser amigável e/ou totalmente automatizada. Neste artigo, demonstramos o funcionamento do NETQUANT13, um aplicativo disponível gratuitamente que pode executar quantificação líquida de microfluorescência totalmente automatizada imparcial. O aplicativo tem uma interface gráfica amigável (GUI) e pode realizar análisede célula única. O software quantifica a NETose em uma imagem detectando as mudanças morfológicas na área do marcador ligado ao DNA-NET, a descondensação da cromatina associou a deformação do núcleo e o aumento da relação de proteína dna:NET-bound. Em conjunto, os múltiplos critérios de definição NET permitem uma quantificação líquida rigorosa em vários conjuntos de dados de forma imparcial.
Protocol
Representative Results
Discussion
A formação NET é uma adição relativamente recente ao diverso armamentarium neutrófilo4 e tem havido uma onda notável de interesse para estudar a implicação de NETs em uma ampla gama de áreas de pesquisa5,7,14,15. A aquisição de imagens usando microscopia de imunofluorescência e quantificação subsequente baseada em imagem é um método amplamente utilizado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi financiado pela Fundação Crafoord (TM e PN), concessão de Pesquisa do Governo Sueco (PN, TM), conselho de pesquisa sueco (PN) e Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
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