NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量
Summary
ここでは、好中球細胞外トラップ(NET)を生成し、NETQUANTを動作させるプロトコルを提示し、免疫蛍光画像におけるNETの定量のための全自動ソフトウェアオプションを提示する。
Abstract
好中球細胞外トラップ(NET)は、DNAおよび顆粒由来抗菌タンパク質からなるウェブ様抗菌構造である。免疫蛍光顕微鏡および画像ベースの定量方法は、好中球細胞外トラップ形成を定量するための重要なツールを残しています。ただし、NET の定量に現在使用できる免疫蛍光ベースの方法には、主な制限があります。イメージ ベースの NET 定量化の手動方法は、多くの場合、主観的で、エラーが発生しやすく、ユーザー、特に経験の浅いユーザーにとっては面倒です。また、定量化のための現在利用可能なソフトウェアオプションは、半自動または操作前にトレーニングが必要です。ここでは、NETQUANTと呼ばれるNET形成を評価するための自動免疫蛍光ベースの画像定量法の実装を示す。ソフトウェアは使いやすく、ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を持っています。表面積やDNA:NETマーカータンパク質比の増加、核変形など生物学的に関連するパラメータを考慮してNET形成を定義します。さらに、このツールは自由に利用できるアプリとして構築され、単一セル分解能の定量化と分析を可能にします。
Introduction
好中球は、多種多様な微生物病原体1に対する先天的な宿主防御応答の重要なメディエーターである。彼らは、抗菌タンパク質2の広い配列を含む顆粒を放出することによって、その抗菌機能を実行し、活性酸素種(ROS)および次亜塩素酸塩1を産生し、食細胞症3を介して生じる。また、ブリンクマンら4は、好中球が侵入病原体を捕捉し排除する新しいメカニズムとして好中球細胞外トラップ(NETs)を記載した。彼らの発見は10年以上前4年に以来、NETは感染性5、6および非感染性7罹患率の多種多様に関与してきた。NET形成は活性プロセスであり、顆粒由来抗菌タンパク質8で被覆されたクロマチンDNAの押出をもたらす。NET形成に関連する細胞および核形態の主要な変化のいくつかは、核形態の喪失、クロマチン縮合、細胞質から核への顆粒タンパク質の動員および核および細胞直径の増加を含む。
ウェブ様NETは、細胞よりもわずかに大きい拡散構造として、または単一の好中球よりも数倍大きい構造として見えることがあり、NETosis5、10の指標と考えられる。蛍光顕微鏡を用いて、4′,6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール(DAPI)などの蛍光プローブでDNAを探査し、好中球エラスターゼなどのNET結合タンパク質に対する免疫蛍光染色によりNETを検出できます。DNAおよびNET結合タンパク質に対する染色の重なり領域の定量は、画像11におけるNETの下の総面積を決定する。
NETs11、12の蛍光画像ベースの定量を行うために、多くの画像解析オプションが利用可能である。しかし、これらのソフトウェアオプションは、ユーザーフレンドリーで完全に自動化されていないという制限があります。この記事では、バイアスのかからなからり完全に自動化された免疫蛍光顕微鏡顕微鏡画像ベースのNET定量を実行できる、自由に利用できるアプリ「NETQUANT13」の動作を実演します。アプリは、ユーザーフレンドリーなグラフィカルインターフェイス(GUI)を持っており、単一セル分析を実行することができます。本ソフトウェアは、DNA-NET結合マーカーの領域における形態学的変化を検出することにより、画像中のNETosisを定量し、クロマチンは核の変形に関連し、DNA:NET結合タンパク質比の増加を検出する。複数の NET 定義基準を組み合わせることで、複数のデータ セット間で厳密な NET 定量を公平に行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
NET形成は、多様な好中球武装体4に比較的最近の付加であり、幅広い研究領域5、7、14、15におけるNETの影響を研究することに関心が高まっています。免疫蛍光顕微鏡を用いた画像の取得とその後の画像ベースの定量は、NETを定量するために広く使用されている方法です。このアプ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、クラフォード財団(TMおよびPN)、スウェーデン政府研究助成金(PN、TM)、スウェーデン研究評議会(PN)、グロシンスキー財団(TM、PN)によって資金提供されました。
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
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