Superficie-realzado resonancia Raman dispersión Nanoprobe Ratiometry para la detección de cáncer ovárico microscópico a través del Receptor del folato dirigidos a
Summary
Cáncer de ovario forma metástasis a lo largo de la cavidad peritoneal. Aquí, presentamos un protocolo y uso ácido fólico-receptor dirigido resonancia superficie-realzada Raman scattering crónicas que revelan estas lesiones con alta especificidad por radiométrica la proyección de imagen. Las crónicas son administrados por vía intraperitoneal a los ratones vivos, y las imágenes derivadas se correlacionan con la histología.
Abstract
Cáncer de ovario representa la neoplasia ginecológica más mortífera. Mayoría de los pacientes actualmente en una fase avanzada (estadio de la FIGO III o IV), cuando ya ha ocurrido metastásica local extendido. Sin embargo, cáncer de ovario tiene un patrón único de diseminación metastásica, implantes de tumor inicialmente están contenidos dentro de la cavidad peritoneal. Esta característica podría permitir, en principio, la resección completa de implantes tumorales con intención curativa. Muchas de estas lesiones metastáticas son microscópicos, haciéndolos difíciles de identificar y tratar. Neutralizar dichas micrometástasis se cree que es una meta importante hacia la eliminación de la repetición del tumor y lograr supervivencia a largo plazo. Con superficie mayor resonancia Raman scattering crónicas la proyección de imagen de Raman puede utilizarse para delinear tumores microscópicos con alta sensibilidad, debido a su brillante y bioorthogonal firmas espectrales. Aquí, describimos la síntesis de dos ‘sabores’ de estas crónicas: un anticuerpo funcionalizados que se dirige al receptor de folato — overexpressed en muchos cánceres ováricos — y un nanoprobe control no dirigido, con distintos espectros. Las crónicas son conjuntamente administrados por vía intraperitoneal a los modelos de ratón de adenocarcinoma ovárico humano metastático. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. La cavidad peritoneal de los animales es quirúrgico expuesta, lavada y analizada con un microphotospectrometer de Raman. Posteriormente, las firmas de Raman de las dos crónicas son desacopladas usando un algoritmo de ajuste de mínimos cuadrados clásicos y sus respectivos puntajes dividieron para suministrar una señal radiométrica de folato orientada sobre las puntas de prueba no focalizados. De esta manera, se visualizan metástasis microscópicas con alta especificidad. La principal ventaja de este enfoque es que la aplicación local en la cavidad peritoneal, que se puede realizar convenientemente durante el procedimiento quirúrgico, puede etiquetar tumores sin someter al paciente a la exposición sistémica de nanopartículas. Falso positivo de señales derivadas de fijación no específica de las crónicas sobre las superficies viscerales pueden eliminarse siguiendo un enfoque radiométrica donde crónicas dirigidas y no dirigidas con distintas firmas de Raman se aplican como una mezcla. El procedimiento es todavía limitado por la falta de un Raman amplio campo comercial de sistema de cámaras, que una vez disponible para la aplicación de esta técnica en el quirófano.
Introduction
Con ‘Superficie realzada Raman dispersión’ la proyección de imagen de Raman (SERS) nanopartículas han demostrado gran promesa en la delineación de las lesiones en una variedad de configuraciones y para muchos tumor diferentes tipos de1,2,3,4 . La principal ventaja de las nanopartículas SERS es su firma espectral como huellas dactilares, con ellos detección indiscutible que no se confunde por antecedentes biológicos señales5. Además, la intensidad de la señal emitida se amplifica aún más con el uso de moléculas reporter (tintes) con los máximos de absorbancia con el láser de excitación, dando lugar a la ‘superficie mayor resonancia Raman dispersión’ (SERR) nanopartículas con mayor sensibilidad6,7,8,9,10,11,12.
Una barrera que debe ser abordado para la adopción de SE(R)RS nanopartículas13 y muchos otras nanopartículas construcciones14,15 para uso clínico son su modo de administración, como inyección intravenosa causa sistémica exposición del agente y exige pruebas extensas para excluir los efectos adversos. En este artículo, presentamos un paradigma diferente basado en la aplicación de nanopartículas localmente en vivo, directamente en la cavidad peritoneal durante la cirugía, seguida por un paso de lavado para eliminar cualquier nanopartículas1. Este enfoque está en consonancia con nuevos enfoques terapéuticos que están actualmente bajo investigación que también hacen uso de la instilación local de agentes en la cavidad peritoneal, llamada quimioterapia intraperitoneal hipertérmica (HIPEC). Así, el principio sí mismo debe ser relativamente fácil de integrar en un flujo de trabajo clínico. Han estudiado la biodistribución de las nanopartículas, después de la aplicación intraperitoneal y no han observado ninguna absorción detectable en la circulación sistémica1. Además, el enfoque de aplicación local evita el secuestro de nanopartículas por el sistema reticuloendotelial, así que el número de nanopartículas requeridas se reduce notablemente. Sin embargo, cuando se aplica tópicamente, nanopartículas funcionalizadas anticuerpos tienden a adherirse en las superficies viscerales incluso en la ausencia de su objetivo. Para minimizar falsas señales positivas debido a la adherencia inespecífica nanopartículas, seguimos un enfoque radiométrica, donde un nanoprobe molecularmente dirigida proporciona la señal específica y un control no dirigido nanoprobe, con diferente espectro de Raman, cuentas de fondo no específica16,17. Hemos demostrado esta metodología de aplicación tópica resonancia mayor superficie espectroscopía de Raman radiométrica recientemente en un modelo murino de cáncer de ovario difuso1.
El objetivo general de este método es desarrollar dos crónicas de SERR, uno blanco y uno no específico, para ser aplicado localmente en modelos de ratón, para la prevalencia de la sobreexpresión de un cáncer de la imagen relacionadas con biomarcadores usando la detección radiométrica de las dos sondas a través de La proyección de imagen de Raman. En este trabajo, el receptor de folato (FR) fue elegido como el destino, ya que es un marcador upregulated en muchos cánceres de ovario18,19. Microfilmes de Raman con nanopartículas de SERS también ha demostrado para el cáncer de la célula identificación20. Se sintetizan dos “sabores” distintos de las nanopartículas de Raman, cada uno derivar su huella digital de un colorante orgánico diferente. Las nanopartículas consisten en un núcleo de oro en forma de estrella, rodeado de un caparazón de sílice y demostrar resonancia de plasmón superficial en aproximadamente 710 nm. El reportero de Raman (tinte orgánico) se deposita al mismo tiempo que la formación de la cáscara de silicona. Finalmente, para las crónicas orientada a FR (αFR-NPs) el caparazón de sílice se conjuga con los anticuerpos, mientras que las crónicas no dirigidos (nt-NPs) son apaciguadas con una monocapa de polietilenglicol (PEG).
Esta técnica fue utilizada con éxito para los tumores microscópicos en un modelo murino de xenoinjerto de cáncer ovárico metastático difuso (SKOV-3), demostrando su aplicabilidad para el uso en vivo. También puede ser extendido para el uso en tejidos suprimidos, para phenotyping de tumor, o la determinación de margen después de la citorreducción como se muestra en un estudio cognado21.
SERR crónicas proporcionan una sólida plataforma para la creación de múltiples etiquetas específicas para biomarcadores, sintetizados con las reacciones químicas directas como se indica esquemáticamente en la figura 1. Aquí, presentamos el protocolo para la síntesis de los dos tipos de SERR crónicas (secciones 1-3), el desarrollo de un modelo de ratón de cáncer de ovario adecuado (sección 4), la administración de crónicas e imágenes (sección 5) y finalmente el análisis de datos y visualización (sección 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona la instrucción para la síntesis de dos “sabores” de SERR crónicas y su empleo en ratones para Raman imaging de ovario tumor overexpressing el Receptor de folato, usando un algoritmo radiométrica. La principal ventaja de Raman imaging sobre otras técnicas de imagen ópticas (tales como de fluorescencia) es la alta especificidad de la señal nanoprobe que no puede confundirse con las señales de origen biológico. En esta encarnación de la proyección de imagen de Raman, las na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se reconocen las siguientes fuentes de financiación (a M.F.K.): NIH R01 EB017748 y R01 CA222836 K08 CA16396; Convocatoria de Damon Runyon-Rachleff innovación Premio RRD-29-14, Plaza Pershing Sohn premio por la Plaza Pershing Sohn cáncer investigación Alianza y MSKCC centro de imagen Molecular y nanotecnología (CMINT) y desarrollo de la tecnología. Agradecimientos se extienden también a la ayuda de donaciones de fondos proporcionada por la concesión de núcleo de NIH de MSKCC (P30-CA008748).
Materials
| Name of Reagent | |||
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
| Name of Equipment | |||
| Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
| inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |
References
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