Eierstockkrebs bildet Metastasen in die Bauchhöhle. Hier präsentieren wir ein Protokoll machen und Verwendung Folat-Rezeptor gezielt Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden, die diese Läsionen mit hoher Spezifität über ratiometrischen Bildgebung zu offenbaren. Die Nanosonden lebenden Mäusen intraperitoneal verabreicht werden, und die abgeleitete Bilder korreliert gut mit der Histologie.
Eierstockkrebs ist die tödlichsten gynäkologische Malignom. Die meisten Patienten präsentieren sich in einem fortgeschrittenen Stadium (FIGO-Stadium III oder IV), wenn lokale Metastasen verbreiten bereits stattgefunden hat. Eierstock-Krebs hat ein einzigartiges Muster der Metastasierung, in diesem Tumor Implantate zunächst in der Bauchhöhle enthalten sind. Diese Funktion könnte im Prinzip die komplette Resektion des Tumors Implantate mit heilender Absicht. Viele dieser metastatischen Läsionen sind mikroskopisch, so dass sie schwer zu erkennen und zu behandeln. Neutralisierung solcher Fixierungsprotokoll gilt als ein wichtiges Ziel zur Beseitigung von Tumor-Rezidiv und langfristiges Überleben zu erreichen. Raman imaging mit Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden kann verwendet werden, um mikroskopisch kleine Tumoren mit hoher Empfindlichkeit, durch ihre helle und Bioorthogonal spektrale Signaturen zu umreißen. Hier beschreiben wir die Synthese von zwei “Varianten” von solchen Nanosonden: ein Antikörper funktionalisiert derjenige, der die Folat-Rezeptor richtet sich an – in vielen Ovarialkarzinome überexprimiert — und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit unterschiedlichen Spektren. Die Nanosonden sind gemeinsam verwalteten intraperitoneal, Maus-Modellen der metastatischen menschlichen Eierstock Adenokarzinom. Alle Tierversuche stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Die Bauchhöhle der Tiere ist chirurgisch ausgesetzt, gewaschen und mit einem Raman Microphotospectrometer gescannt. Anschließend die Raman-Unterschriften von zwei Nanosonden sind entkoppelten mit einem klassischen Least Squares passenden Algorithmus, und ihre jeweiligen Noten aufgeteilt, um ein ratiometrischen Signal von Folat gezielt über ungezielte Sonden zu liefern. Auf diese Weise werden mikroskopische Metastasen mit hoher Spezifität visualisiert. Der größte Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die lokale Anwendung in der Bauchhöhle – was kann bequem während des chirurgischen Eingriffs erfolgen – können tag Tumoren ohne systemische Nanopartikel Exposition des Patienten zu unterwerfen. Falsche Positive Signale aus unspezifischen Bindung der Nanosonden auf viszerale Oberflächen beseitigt werden kann, von einem ratiometrischen Ansatz folgend, wo gezielte und ungezielte Nanosonden mit unterschiedlichen Raman-Signaturen als Mischung angewandt. Das Verfahren ist derzeit noch begrenzt durch den Mangel an einer kommerziellen Weitfeld-Raman imaging Kamerasystem, wodurch einmal verfügbar für die Anwendung dieser Technik in den OP-Saal.
Raman imaging mit “Oberfläche verstärkten Raman-Streuung” (SERS) Nanopartikel zeigte große Versprechung in Abgrenzung Läsionen in einer Vielzahl von Einstellungen und für viele verschiedene Tumor Typen1,2,3,4 . Der Hauptvorteil von SERS Nanopartikeln ist ihr Fingerabdruck-ähnliche spektrale Signatur, bieten ihnen unzweifelhaft erkennen, die nicht durch biologische Hintergrund Signale5verwechselt wird. Darüber hinaus ist die Intensität des abgestrahlten Signals verstärkt mit dem Einsatz von Reporter Moleküle (Farbstoffe) mit Absorption Maxima im Einklang mit der Erregung Laser, verursachend “Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung” (SERRS) Nanopartikel mit einer noch größeren Empfindlichkeit6,7,8,9,10,11,12.
Eine Barriere, die für die Annahme von SE(R)RS Nanopartikel13 behandelt werden muss und viele andere Nanopartikel Konstrukte14,15 für den klinischen Einsatz ist ihre Art der Verabreichung, als intravenöser Injektion systemische Ursachen Exposition des Agenten, und erfordert umfangreiche Tests, um mögliche Nebenwirkungen ausschließen. In diesem Artikel präsentieren wir ein anderes Paradigma, basierend auf der Anwendung von Nanopartikeln lokal in Vivo, direkt in der Bauchhöhle während der Operation, gefolgt von einen Waschschritt jede ungebundene Nanopartikel1entfernen. Dieser Ansatz steht im Einklang mit neue therapeutische Ansätze, die derzeit untersucht werden, die auch von lokalen Instillation von Agenten in der Bauchhöhle, genannt hyperthermische intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC) verwenden. So sollte das Prinzip selbst relativ einfach in einem klinischen Workflow zu integrieren. Wir haben die Bioverteilung der Nanopartikel nach intraperitonealer Anwendung untersucht, und nachweisbaren Absorption in den systemischen Kreislauf1nicht eingehalten. Darüber hinaus umgeht die lokale Anwendung Ansatz die Sequestrierung von Nanopartikeln vom retikuloendothelialen System, so dass die Zahlen von Nanopartikeln erforderlich deutlich reduziert werden. Allerdings neigen bei topischer Anwendung, Antikörper-funktionalisiert Nanopartikel auf die viszerale Oberfläche auch in Abwesenheit von ihr Ziel einzuhalten. Um falsche positive Signale durch unspezifische Nanopartikel Haftung zu minimieren, verfolgen wir einen ratiometrischen Ansatz sieht eine Molekular gezielten Nanoprobe spezifisches Signal und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit verschiedenen Raman-Spektrum, Konten für unspezifische Hintergrund16,17. Wir haben diese Methode der topisch applizierten Oberflächen verstärkte Resonanz ratiometrischen Ramanspektroskopie vor kurzem in einem Mausmodell der diffusen Eierstockkrebs1gezeigt.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zwei SERRS Nanosonden, eine gezielt zu entwickeln und eine unspezifische, lokal in Mausmodellen, angewendet werden, um die Prävalenz/Überexpression des Krebses Bild im Zusammenhang mit ratiometrischen Erkennung der beiden Sonden biomarker über Raman imaging. In dieser Arbeit wurde der Folat-Rezeptor (FR) als das Ziel gewählt, da dies ein Marker hochreguliert in viele Ovarialkarzinome18,19. Raman Microimaging mit SERS-basierte Nanopartikel wurde ebenfalls für Krebs Zelle Identifikation20nachgewiesen. Zwei unterschiedliche “Varianten” von Raman Nanopartikel sind, jeweils ein unterschiedlicher organischer Farbstoff seinen Fingerabdruck ableiten synthetisiert. Die Nanopartikel bestehen aus einem sternförmigen gold Kern von einer Silikon-Hülle umgeben und zeigen Oberflächenplasmonenresonanz auf rund 710 nm. Die Raman-Reporter (organischer Farbstoff) lagert sich gleichzeitig mit der Bildung von Kieselsäure Schale. Schließlich ist für die FR-gezielte Nanosonden (αFR-NPs) die Kieselsäure-Shell mit Antikörpern, konjugiert, während die ungezielte Nanosonden (nt-NPs) mit einer Monoschicht von Polyethylenglykol (PEG) passiviert werden.
Diese Technik wurde erfolgreich zur mikroskopische Tumoren in einem Mausmodell Xenograft der diffus metastasierten Ovarialkarzinom (SKOV-3), demonstriert seine Eignung für den Einsatz in-vivo Karte. Es kann auch für den Einsatz in ausgeschnittenen Gewebe für Tumor Phänotypisierung oder Marge Bestimmung nach Gallerte wie gezeigt in einer verwandten Studie21erweitert werden.
SERRS Nanosonden bieten eine robuste Plattform für die Erstellung von mehreren gezielten Tags für Biomarker, mit einfachen chemischen Reaktionen synthetisiert, wie in Abbildung 1schematisch dargestellt. Hier stellen wir das Protokoll für die Synthese der zwei Arten von SERRS Nanosonden (Abschnitte 1 bis 3), die Entwicklung einer geeigneten Eierstockkrebs-Maus-Modell (Abschnitt 4), die Verwaltung von Nanosonden und Bildgebung (Kapitel 5) und schließlich die Datenanalyse und Visualisierung (siehe Abschnitt 6).
Das hier beschriebene Protokoll bietet Unterricht für die Synthese von zwei “Varianten” von SERRS Nanosonden und ihre Beschäftigung bei Mäusen für Raman imaging ovarian Tumors überexprimierenden Folat-Rezeptor, mit einem ratiometrischen Algorithmus. Der wesentliche Vorteil der Raman imaging über andere optische bildgebenden Verfahren (z. B. Fluoreszenz) ist der hohen Spezifität der Nanoprobe Signal, das mit keine Signale biologischen Ursprungs verwechselt werden kann nicht. Bei dieser Ausführungsform der Raman im…
The authors have nothing to disclose.
Die folgenden Finanzierungsquellen (zu M.F.K.) sind anerkannt: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 und K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn Preis durch die Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance und MSKCC-Mitte für molekulare Bildgebung & Nanotechnologie (CMINT) und Technologieentwicklung gewährt. Bestätigungen sind auch die Zuschüsse Unterstützung durch die MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748) erweitert.
Name of Reagent | |||
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
*IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
Name of Equipment | |||
Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |