Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting
Summary
Cancro ovarico forma metastasi durante la cavità peritoneale. Qui, presentiamo un protocollo per rendere e uso folato-recettore mirati a risonanza superficie-enhanced Raman scattering nanosonde che rivelano queste lesioni con formazione immagine di alta specificità via raziometrici. Le nanosonde sono amministrati intraperitonealmente ai topi vivi, e le immagini derivate correlano bene con l’istologia.
Abstract
Cancro ovarico rappresenta la malignità ginecologica più letale. Maggior parte dei pazienti presentano in stadio avanzato (stadio FIGO III o IV), quando già verificata una diffusione metastatica di locale. Tuttavia, il cancro ovarico ha un unico modello di diffusione metastatica, in quanto gli impianti del tumore inizialmente sono contenuti all’interno della cavità peritoneale. Questa caratteristica potrebbe consentire, in linea di principio, la resezione completa del tumore impianti con intento curativo. Molte di queste lesioni metastatiche sono microscopici, che li rende difficili da identificare e trattare. Neutralizzare tali micrometastasi è creduto per essere un obiettivo importante verso l’eliminazione di ricorrenza del tumore e sopravvivenza a lungo termine di raggiungimento. Raman imaging con superficie maggiore risonanza Raman scattering nanosonde può essere utilizzato per delineare microscopici tumori con l’alta sensibilità, grazie alla loro brillante e bioorthogonal firme spettrali. Qui, descriviamo la sintesi di due ‘sapori’ di tali nanosonde: un anticorpo-funzionalizzati di uno che il recettore per acido folico è destinato — sovraespresso in molti cancri ovarici — e una Nanosonda controllo non mirati, con distinti spettri. Le nanosonde sono co-somministrati per via intraperitoneale di modelli murini di adenocarcinoma ovarico umano metastatico. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Cavità peritoneale degli animali è chirurgicamente esposti, lavata e scansionata con un microphotospectrometer di Raman. Successivamente, le firme di Raman delle due nanosonde sono disaccoppiate utilizzando un algoritmo di montaggio classico minimi quadrati, e i loro rispettivi punteggi suddivisi per fornire un segnale raziometrico di folato-mirati tramite sonde non mirati. In questo modo, metastasi microscopiche sono visualizzate con elevata specificità. Il principale vantaggio di questo approccio è che l’applicazione locale nella cavità peritoneale — che può essere fatto comodamente durante la procedura chirurgica — puoi taggare i tumori senza sottoporre il paziente all’esposizione sistemica di nanoparticelle. Falsi positivi segnali derivanti dal legame non specifico di nanosonde su superfici viscerali possono essere eliminati seguendo un approccio raziometrici dove nanosonde mirate e non mirati con distinte firme Raman sono applicati come una miscela. La procedura è attualmente ancora limitata dalla mancanza di un commerciale grandangolari Raman imaging sistema di telecamere, che una volta disponibile consentirà l’applicazione di questa tecnica in sala operatoria.
Introduction
Imaging con ‘surface enhanced Raman scattering’ Raman (SERS) nanoparticelle ha mostrato grande promessa nel delineare le lesioni in una varietà di impostazioni e per molti differenti del tumore tipi1,2,3,4 . Il vantaggio principale di nanoparticelle SERS è la loro firma spettrale di impronte digitali-come, offrendo loro indiscutibile rilevazione che non è confuso dal fondo biologico segnali5. Inoltre, l’intensità del segnale emesso viene ulteriormente amplificato con l’uso di molecole reporter (coloranti) con massimi di assorbanza in linea con il laser di eccitazione, dando luogo a ‘superficie maggiore risonanza Raman scattering’ (SERRS) nanoparticelle con ancora maggiore sensibilità6,7,8,9,10,11,12.
Una barriera che deve essere affrontato per l’adozione del SE(R)RS nanoparticelle13 e molti altri nanoparticella costrutti14,15 per uso clinico è la loro modalità di somministrazione, come iniezione endovenosa cause sistemiche esposizione dell’agente e necessita di test approfonditi per escludere potenziali effetti avversi. In questo articolo, vi presentiamo un altro paradigma basato sull’applicazione di nanoparticelle localmente in vivo, direttamente nella cavità peritoneale durante la chirurgia, seguita da una fase di lavaggio per rimuovere eventuali nanoparticelle non associati1. Questo approccio è in linea con i nuovi approcci terapeutici che sono attualmente sotto inchiesta che fanno anche uso di instillazione locale di agenti nella cavità peritoneale, chiamata chemioterapia ipertermica intraperitoneale (HIPEC). Così, lo stesso principio dovrebbe essere relativamente facile da integrare in un flusso di lavoro clinico. Abbiamo studiato la biodistribuzione delle nanoparticelle dopo applicazione intraperitoneale e non hanno osservato alcun assorbimento rilevabile nella circolazione sistemica1. Inoltre, l’approccio di applicazione locale aggira il sequestro delle nanoparticelle dal sistema reticoloendoteliale, così i numeri delle nanoparticelle richieste sono marcatamente ridotti. Tuttavia, quando applicato localmente, nanoparticelle funzionalizzate anticorpo tendono ad aderire sulle superfici viscerali anche in assenza del loro obiettivo. Al fine di ridurre al minimo i falsi segnali positivi a causa di adesione delle nanoparticelle non specifici, perseguiamo un approccio raziometrici, dove una Nanosonda molecolare mirata fornisce il segnale specifico e una Nanosonda controllo non mirati, con differente spettro Raman, conti per fondo16,17. Abbiamo dimostrato questa metodologia di risonanza maggiore superficie topica spettroscopia raziometrici Raman recentemente in un modello murino di cancro ovarico diffuso1.
L’obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare due SERRS nanosonde, uno destinato ed uno non-specifici, da applicare localmente in modelli murini, per la prevalenza e la sovraespressione di un cancro di immagine relativo biomarcatore utilizzando raziometrici rilevamento delle due sonde via Raman imaging. In questo lavoro, il recettore per acido folico (FR) è stato scelto come destinazione, si tratta di un marcatore upregulated in molti cancri ovarici18,19. Raman microimaging con nanoparticelle basato su SERS è stata dimostrata anche per cancro cella identificazione20. Due distinti “sapori” di nanoparticelle di Raman sono sintetizzati, ciascuna derivazione l’impronta digitale da un colorante organico differente. Le nanoparticelle sono costituiti da un nucleo d’oro a forma di stella, circondato da un guscio di silice e dimostrare la risonanza plasmonica di superficie a circa 710 nm. Il reporter di Raman (colorante organico) è depositato in concomitanza con la formazione del guscio di silice. Infine, per le nanosonde FR-mirati (αFR-NPs) il guscio di silice è coniugato con gli anticorpi, mentre le nanosonde non mirati (nt-NPs) sono passivati con un monostrato di polietilenglicole (PEG).
Questa tecnica è stata usata con successo per mappare i tumori al microscopio in un modello di xenotrapianto di topo di cancro ovarico metastatico diffuso (SKOV-3), dimostrando la sua applicabilità per uso in vivo. Può anche essere esteso per uso nei tessuti asportati, fenotipizzazione del tumore, o determinazione di margine dopo debulking come mostrato in un cognate Studio21.
SERRS nanosonde forniscono una robusta piattaforma per la creazione di Tag più mirati per biomarcatori, sintetizzati con semplici reazioni chimiche come indicato schematicamente in Figura 1. Qui, presentiamo il protocollo per la sintesi dei due tipi di nanosonde SERRS (sezioni 1-3), lo sviluppo di un modello murino di cancro ovarico adatto (sezione 4), l’amministrazione di nanosonde e imaging (sezione 5) e infine l’analisi dei dati e visualizzazione (sezione 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui vengono fornite istruzioni per la sintesi di due “gusti” di nanosonde SERRS e il loro impiego nei topi per Raman imaging del tumore ovarico che iperesprimono il recettore del folato, utilizzando un algoritmo raziometrici. Il vantaggio principale di Raman imaging rispetto ad altre tecniche di imaging ottici (quali la fluorescenza) è l’alta specificità del segnale Nanosonda che non può essere confuso con eventuali segnali di origine biologica. In questa incarnazione del Raman imaging, le nano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le seguenti fonti di finanziamento (per MFK) sono riconosciute: NIH R01 EB017748, CA222836 R01 e K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, premio Sohn Piazza Pershing Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance, MSKCC centro per Imaging molecolare & nanotecnologia (CMINT) e lo sviluppo della tecnologia e concede. I riconoscimenti sono estesi anche al supporto sovvenzioni fornito dalla concessione MSKCC NIH Core (P30-CA008748).
Materials
| Name of Reagent | |||
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
| Name of Equipment | |||
| Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
| inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |
References
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