Câncer de ovário forma metástases em toda a cavidade peritoneal. Aqui, apresentamos um protocolo para fazer e uso folato receptores alvo superfície melhorada ressonância nanosondas de espalhamento Raman que revelam estas lesões com alta especificidade através de ratiometric de imagem. As nanosondas são administradas intraperitonealmente com ratos vivos, e as imagens derivadas se correlacionam bem com a histologia.
Câncer de ovário representa a malignidade ginecológica mais mortal. A maioria dos pacientes apresentam-se em estágio avançado (fase de FIGO III ou IV), quando local metastático espalhar já ocorreu. No entanto, o câncer de ovário tem um padrão único de propagação metastática, em que os implantes de tumor inicialmente estão contidos dentro da cavidade peritoneal. Esse recurso pode permitir, em princípio, a ressecção completa do tumor implantes com intenção curativa. Muitas dessas lesões metastáticas são microscópicas, tornando-os difíceis de identificar e tratar. Neutralizar tais micrometastases é acreditado para ser dos principais objetivos no sentido de eliminar a recorrência do tumor e alcançar a sobrevivência a longo prazo. Raman de imagem com ressonância maior superfície nanosondas de espalhamento Raman pode ser usado para delinear tumores microscópicos com alta sensibilidade, devido a sua brilhante e opaco assinaturas espectrais. Aqui, descrevemos a síntese dos dois ‘sabores’ de tais nanosondas: um anticorpo-acrescida que tem como alvo os receptores de ácido fólico — overexpressed em muitos cancros ovarianos — e um nano-sonda não específico de controle, com espectros distintos. As nanosondas são co administradas intraperitonealmente para modelos de rato de adenocarcinoma de ovário humano metastático. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. A cavidade peritoneal dos animais é cirurgicamente exposta, lavada e digitalizada com um microphotospectrometer Raman. Posteriormente, as assinaturas de Raman das dois nanosondas são dissociadas usando um algoritmo de ajuste clássico mínimos quadrados, e seus respectivos escores dividido para fornecer um sinal de ratiometric de ácido fólico-orientados sobre sondas não segmentadas. Desta forma, metástases microscópicas são visualizados com alta especificidade. A principal vantagem dessa abordagem é que a aplicação local na cavidade peritoneal — que pode ser feito convenientemente durante o procedimento cirúrgico — pode marcar tumores sem submeter o paciente a exposição sistémica de nanopartículas. Falso positivo sinais decorrentes da ligação não-específica das nanosondas sobre superfícies viscerais podem ser eliminados, seguindo uma abordagem de ratiometric onde nanosondas visadas e não específico com assinaturas de Raman distintas são aplicadas como uma mistura. O procedimento atualmente ainda é limitado pela falta de um comercial Raman de campo amplo sistema de câmera, permitindo que uma vez disponível para a aplicação desta técnica no teatro operacional de imagem.
Raman, imagem latente com ‘Espalhamento Raman reforçada superfície’ nanopartículas (SERS) tem mostrado grande promessa em delineating lesões em uma variedade de configurações e para muitos tumor diferentes tipos1,2,3,4 . A principal vantagem de nanopartículas SERS é sua assinatura espectral, como impressão digital, que lhes permite a deteção inquestionável que não é confundida por sinais de fundo biológico5. Além disso, a intensidade do sinal emitido é ainda mais amplificada com a utilização de moléculas de repórter (corantes) com maxima de absorvância em consonância com o laser de excitação, dando origem a ‘superfície reforçada ressonância Raman dispersando’ (SERRS) nanopartículas com ainda maior sensibilidade6,7,8,9,10,11,12.
Uma barreira que precisa ser abordado para a adopção de nanopartículas de SE(R)RS13 e muitas outras nanopartículas construções14,15 para uso clínico são seu modo de administração, como injeção intravenosa provoca sistêmica exposição do agente e exige testes extensivos para excluir potenciais efeitos adversos. Neste artigo, apresentamos um paradigma diferente, baseado na aplicação de nanopartículas localmente na vivo, diretamente para a cavidade peritoneal durante a cirurgia, seguido por uma etapa de lavagem para remover qualquer nanopartículas desacoplado1. Esta abordagem está em consonância com novas abordagens terapêuticas que estão atualmente sob investigação que também fazem uso da instilação local de agentes na cavidade peritoneal, chamada quimioterapia intraperitoneal hipertérmica (HIPEC). Assim, o princípio em si deve ser relativamente fácil de integrar em um fluxo de trabalho clínico. Nós estudaram a biodistribuição das nanopartículas após aplicação intraperitoneal e não observaram qualquer absorção detectável para a circulação sistêmica1. Além disso, a abordagem de aplicação local contorna o sequestro de nanopartículas pelo sistema reticuloendotelial, portanto os números de nanopartículas necessários são marcadamente reduzidos. No entanto, quando aplicada topicamente, anticorpo-acrescida de nanopartículas tendem aderir nas superfícies viscerais mesmo na ausência de seu alvo. A fim de minimizar os sinais positivos falsos devido à adesão de nanopartículas não-específica, buscamos uma abordagem ratiometric, onde um nano-sonda molecularmente orientada fornece o sinal específico e um nano-sonda não específico de controlo, com diferente espectro Raman, contas para plano de fundo específico16,17. Nós demonstramos esta metodologia aplicada topicamente superfície reforçada de ressonância espectroscopia Raman de ratiometric recentemente em um modelo do rato do câncer de ovário difusa1.
O objectivo geral deste método é desenvolver dois SERRS nanosondas, um alvo e um específico, a ser aplicado localmente em modelos do rato, para a prevalência/superexpressão de um câncer de imagem relacionados biomarcador ratiometric detecção das duas sondas através Raman de imagem. Neste trabalho, o receptor de folato (FR) foi escolhido como alvo, como este é um marcador upregulated em muitos cancros ovarianos18,19. Raman microfilmagem com nanopartículas SERS-baseado também tem sido demonstrada por câncer célula identificação20. Dois distintos “sabores” de Raman nanopartículas são sintetizados, cada um derivando sua impressão digital de um corante orgânico diferente. As nanopartículas consistem de um núcleo de ouro em forma de estrela, rodeado por uma concha de silicone e demonstrar a ressonância de plasmon de superfície em aproximadamente 710 nm. O repórter de Raman (corante orgânico) é depositado em simultâneo com a formação do reservatório de sílica. Finalmente, para as nanosondas FR-alvo (αFR-NPs) a concha de silicone é conjugada com anticorpos, Considerando que as nanosondas não específico (nt-NPs) são passivadas com uma monocamada de polietileno glicol (PEG).
Esta técnica foi utilizada com sucesso para mapear tumores microscópicos em um modelo de enxerto heterólogo do rato difuso metastático do câncer de ovário (SKOV-3), demonstrando sua aplicabilidade para o uso in vivo. Ele também pode ser estendido para uso em tecidos extirpados, para fenotipagem do tumor, ou determinação de margem depois Eu diminuo como mostrado em um estudo cognato21.
SERRS nanosondas fornecem uma plataforma robusta para a criação de várias marcas direcionadas para biomarcadores, sintetizados com reações químicas simples, como descrito esquematicamente na Figura 1. Aqui, apresentamos o protocolo para a síntese dos dois tipos de SERRS nanosondas (seções 1-3), o desenvolvimento de um modelo de mouse apropriado câncer de ovário (seção 4), a administração de nanosondas e imagem (secção 5) e finalmente a análise de dados e visualização (secção 6).
O protocolo descrito aqui fornece instruções para a síntese de dois “sabores” do SERRS nanosondas e de emprego em camundongos para Raman de tumor de ovário superexpressão do Receptor de folato, usando um algoritmo de ratiometric de imagem. A principal vantagem de Raman de imagem sobre outras técnicas de imagem ópticas (tais como fluorescência) é a alta especificidade do sinal nanossondas que não pode ser confundido com sinais de origem biológica. Nesta personificação de Raman de imagem, as nanopartículas n?…
The authors have nothing to disclose.
As seguintes fontes de financiamento (para MFK) são reconhecidas: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 e K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff inovação prêmio DRR-29-14, Pershing Square Sohn prêmio pelo Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance, MSKCC centro e para imagiologia Molecular & nanotecnologia (CMINT) e subsídios de desenvolvimento de tecnologia. Agradecimentos também são estendidos para o apoio de conceder financiamento fornecido pela concessão de núcleo do MSKCC NIH (P30-CA008748).
Name of Reagent | |||
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
*IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
Name of Equipment | |||
Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |