Summary

Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Published: October 12, 2018
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per in modo rapido e riproducibile generare articifical biologicamente ispirato, biodegradabile antigene che presenta le cellule (aAPC) con sintonizzabile dimensione, forma e presentazione di proteina di superficie per cellula T espansione ex vivo o in vivo .

Abstract

Cellule presentanti l’antigene artificiale (aAPC) sono una promettente piattaforma per modulazione immune dovuto la loro capacità potente per stimolare le cellule T. Substrati acellulare offrono vantaggi chiave sopra basati su cellule aAPC, compreso un controllo preciso dei parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie aAPC per modulare le interazioni con le cellule T. aAPC costruito da particelle anisotropiche, particelle particolarmente ellissoidali, hanno dimostrato di essere più efficace di contattare loro controparti sferiche a stimolando le cellule di T a causa di grippaggio aumentato e maggiore superficie disponibile per la cellula T, anche come ha ridotto l’assorbimento non specifico e migliorate proprietà farmacocinetiche. Nonostante il crescente interesse anisotropiche particelle, anche ampiamente accettato metodi di generazione di particelle anisotropiche come allungamento del film sottile può essere difficile da implementare e utilizzare in modo riproducibile.

A tal fine, descriviamo un protocollo per la fabbricazione rapida, standardizzato di biodegradabile aAPC anisotropo basati su particelle con dimensioni regolabili, forma e segnale presentazione per cellula T espansione ex vivo o in vivo, insieme ai metodi di caratterizzano la loro dimensione, morfologia e superficie contenuto proteico e per valutare la loro funzionalità. Questo approccio a fabbricare aAPC anisotropico è scalabile e riproducibile, che lo rende ideale per la generazione di aAPC per immunoterapie “standard”.

Introduction

Cellule presentanti l’antigene artificiale (aAPC) hanno indicato la promessa come agenti immunomodulatori perché possono generare una risposta robusta cellula di T antigene-specifiche. Essenziale per queste piattaforme sono la loro capacità di presentare in modo efficiente i segnali cruciali per l’attivazione delle cellule T. AAPC acellular sono un’alternativa attraente ai aAPC basati su cellule perché sono più facili e meno costoso da fabbricare, affrontare sfide meno durante scale-up e traduzione e alleviare i rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. AAPC acellulare consentono anche di un elevato grado di controllo sui parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie che si interfaccia con le cellule di T1.

aAPC deve ricapitolare un minimo di due segnali essenziali per l’attivazione delle cellule T. Segnale 1 fornisce il riconoscimento dell’antigene e si verifica quando il recettore delle cellule T (TCR) riconosce e si impegna con un MHC di classe I o II cuscinetto suo antigene cognata, che culmina nella segnalazione attraverso il complesso TCR. Per ignorare il requisito di specificità dell’antigene, aAPC sistemi spesso sopportano un agonistica dell’anticorpo monoclonale contro il recettore CD3, che non specifico stimola il complesso TCR. Forme ricombinanti di MHC, particolarmente dei multimeri MHC, sono state utilizzate anche sulla superficie della aAPC per fornire la specificità dell’antigene2,3. 2 è un segnale di costimolazione che indirizza l’attività delle cellule T. Per fornire la costimolazione necessari per l’attivazione delle cellule T, il recettore CD28 generalmente viene stimolato con un anticorpo agonista presentato sulla superficie aAPC, sebbene altri recettori costimolazione quali 4-1BB siano stati correttamente mirate4. Proteine di segnale 1 e 2 sono in genere immobilizzati sulla superficie delle particelle rigide di sintetizzare aAPC. Storicamente, aAPC sono stati fabbricati da una varietà di materiali, tra cui polistirolo4,5 e ferro destrano6. Sistemi più recenti utilizzano polimeri biodegradabili come poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per generare aAPC che può essere facilmente accoppiato per proteine di segnale, sono adatti per amministrazione diretta in vivoe può facilitare il rilascio prolungato di incapsulato citochine o fattori solubili per aumentare l’attivazione delle cellule T7,8.

Oltre alla presenza di proteine di segnale necessario, impegno del ricevitore su una superficie sufficientemente grande durante l’interazione aAPC/T è essenziale per l’attivazione delle cellule T. Così, parametri fisici di aAPC quali dimensioni e forma drasticamente alterano la loro area di contatto disponibile e influenzano la loro capacità di stimolare le cellule T. AAPC micron imprese hanno dimostrato di essere più efficace a stimolando le cellule di T di loro su scala nanometrica controparti9,10. Tuttavia, nano-aAPC possono avere biodistribuzione superiore e migliore drenaggio ai linfonodi che possono migliorare la loro prestazione in vivo sopra micro-aAPC11. Forma è un’altra variabile di interesse in sistemi basati su particelle aAPC. Anisotropo aAPC hanno recentemente dimostrato di essere più efficace di particelle isotropiche a stimolando le cellule di T, principalmente a causa di interazione avanzata con cellule bersaglio accoppiato con l’assorbimento riduttore delle cellule aspecifiche. Le cellule legano preferenzialmente all’asse lungo del ellissoidale particelle, e il più grande raggio di curvatura e la superficie più piatta consentono più contatto tra la aAPC e la cellula T12. L’asse lungo di particelle ellissoidali inoltre scoraggia la fagocitosi, con conseguente tempo di circolazione aumentata rispetto a particelle sferiche seguendo in vivo amministrazione12,13. A causa di questi vantaggi, ellissoidale particelle mediano una maggiore espansione di antigene-specifiche cellule T in vitro e in vivo rispetto a particelle sferiche, un effetto osservato al micro e nanoscales12, 13. Ci sono varie strategie per fabbricare particelle anisotropiche, ma film sottile lo stretching è un metodo ampiamente accettato semplice utilizzato per generare una gamma di particelle diverse forme14. A seguito di sintesi, particelle sono gettate nel film e allungate in una o due dimensioni ad una temperatura sopra la temperatura di transizione vetrosa del materiale della particella. Il film è poi sciolto per recuperare le particelle. Nonostante la crescente interesse in particelle anisotropiche, approcci attuali per fabbricazione aAPC basati su particelle sono per lo più limitati ai sistemi isotropi e metodi di alterare la forma delle particelle possono essere difficile da implementare, incompatibile con alcune sintesi aAPC strategie e mancanza di precisione e riproducibilità15. La nostra tecnica di allungamento del film sottile può essere eseguita manualmente o in modo automatico per generare velocemente anisotropiche particelle sintetizzate da una varietà di polimeri biodegradabili, estesa per un rapporto di aspetto desiderato in una o due dimensioni15.

Basato sul nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato un approccio basato su particelle biodegradabile combinato con scalabile tecnologia a film sottile che si estende per generare velocemente aAPC con forma e dimensioni sintonizzabile ad un modo standardizzato per cellula T espansione ex vivo o in vivo. La nostra strategia di coniugazione di proteina può essere utilizzato per accoppiare qualsiasi proteina di interesse per i gruppi carbossilici sulla superficie della particella ad una densità desiderata, dando questo sistema aAPC un elevato grado di flessibilità. Descriviamo anche metodi per caratterizzare la dimensione, la morfologia e la proteina di superficie contenuta di aAPC e per valutare la loro funzionalità in vitro. Questo protocollo può essere facilmente adattato per espandere le cellule immunitarie ex vivo o in vivo per una varietà di applicazioni di immunoterapia.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University. 1. fabbricazione di particelle PLGA sferica di dimensioni sintonizzabile Preparazione di materiali per la sintesi delle particelle Preparare la soluzione al 5% p/p di alcol polivinilico (PVA). Aggiungere 500 mL di acqua deionizzata (DI) in un matraccio di Erlenmeyer con un’ancoretta magnetica e collocare su piastra riscaldante agitato…

Representative Results

Uno schema per il film sottile 2D automatico dispositivo di allungamento è dato in Figura 1. Un disegno schematico e una descrizione per un film sottile di 1D stretching dispositivo è dato Ho et al.17 la barella viene costruita dalle parti di alluminio mediante fresatura standard e tecniche di lavorazione. Simile alla barella 1D, 2D barella è costituito da manopole metalliche e rotaie di guida. Viti di trasmissione bidirezionale ven…

Discussion

Questo protocollo in dettaglio un metodo versatile per la precisa generazione di particelle polimeriche anisotropiche. Il film sottile che allunga la tecnica qui descritta è scalabile, altamente riproducibile e poco costoso. Tecniche alternative per la generazione di particelle anisotropiche soffrono di molte limitazioni, tra cui il costo elevato, bassa velocità effettiva e granulometria limitata. Il film sottile stretching approccio è anche vantaggioso perché le particelle sono modificate per essere anisotropo dopo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EBA (DGE-1746891) e KRR (DGE-1232825) grazie al programma NSF Graduate Research Fellowship per supporto. Grazie RAM nazionali di ricerca servizio premio NIH NCI F31 (F31CA214147) e le ricompense di successo per College scienziati Fellowship per supporto. Gli autori ringraziano il NIH (R01EB016721 e R01CA195503), la ricerca per prevenire la cecità James e Carole gratis Catalyst Award e l’Istituto di Bloomberg-Kimmel JHU per immunoterapia del cancro per il supporto.

Materials

Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

References

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Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

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