כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר במהירות, reproducibly articifical בהשראה ביולוגית, מתכלה אנטיגן הצגת תאים (aAPC) עם tunable גודל, צורה של הדם המצגת ל- T cell הרחבה שמחוץ או ויוו .
תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הם פלטפורמה מבטיח עבור אפנון המערכת החיסונית עקב יכולתם חזק כדי לגרות את תאי T. מצעים acellular מציעים יתרונות מרכזיים על פני מבוססת-תא aAPC, כולל שליטה מדויקת של הפרמטרים מצגת אות ומאפיינים פיזיים של פני השטח aAPC כדי לווסת את האינטראקציות שלה עם תאי T. aAPC בנוי אניסוטרופי חלקיקים, במיוחד אליפסואידי חלקיקים, הוכחו להיות יעילים יותר מאשר עמיתיהם הכדורית שלהם על תאי T מגרה בשל הכריכה מוגברת שטח גדול יותר זמין עבור תא T קשר, גם כן כמו מופחתת ספיגת לא ספציפית, המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת. למרות שהאיחוד חלקיקים אנאיזוטרופי, מקובל אפילו מאוד שיטות של יצירת חלקיקים אניסוטרופי כגון סרט דק מותח עשויה להיות מאתגרת להטמיע ולהשתמש reproducibly.
למטרה זו, אנו מתארים פרוטוקול על הזיוף מהירה, מתוקננת של מתכלה אניסוטרופי מבוסס חלקיק aAPC עם tunable, גודל, צורה, אות מצגת עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו, יחד עם שיטות לאפיין שלהם גודל, מורפולוגיה, תוכן, משטח חלבון כדי להעריך את הפונקציונליות שלהם. גישה זו כדי בודה aAPC אניסוטרופי היא מדרגית, לשחזור, שהופך אותו אידיאלי עבור יצירת aAPC עבור immunotherapies “מדף”.
תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הראו הבטחה כסוכני immunomodulatory כי הם יכולים ליצור תגובה חזקה תא T אנטיגן ספציפי. אתרי פלטפורמות אלו הן את היכולת שלהם ביעילות להציג אותות חיוני להפעלת תא T. Acellular aAPC הם חלופה אטרקטיבית מבוססת-תא aAPC כי הם קלים יותר ויקרות פחות לפברק בפני אתגרים פחות במהלך הסולם ותרגום, להקל על סיכונים הקשורים טיפולים מבוססי תאים. Acellular aAPC מאפשרים גם רמה גבוהה של שליטה על שידור מצגת פרמטרים ומאפיינים פיזיים של השטח, מה ממשק עם T תאים1.
aAPC חייב מסכם את הדברים מינימום של שני אותות חיוניים עבור הפעלת תא T. אות 1 מספק זיהוי אנטיגן, מתרחשת כאשר הקולטן תא T (TCR) מזהה ועוסק עם מחלקה MHC I או II הנושאת אנטיגן cognate שלה, שהגיעה לשיאה ב איתות באמצעות TCR מורכבות. כדי לעקוף את הדרישה ירידה לפרטים אנטיגן, מערכות aAPC לעיתים קרובות נושאים נוגדנים חד-שבטיים היתה ללא-חת כנגד הקולטן CD3, אשר nonspecifically מעוררת את המתחם TCR. צורות רקומביננטי של MHC, במיוחד MHC multimers, גם שימשו על פני השטח של aAPC כדי לספק אנטיגן ירידה לפרטים2,3. אות 2 הוא סימן costimulatory מנחה את תא T פעילות. כדי לספק את costimulation הדרוש להפעלת תא T, הקולטן CD28 מגורה באופן כללי עם נוגדן היתה ללא-חת הציגו על פני השטח aAPC, למרות קולטנים costimulatory אחרים כגון 4-1BB היה יישוב בהצלחה4. אות 1 ו-2 חלבונים ללא יכולת תנועה הם בדרך כלל על פני השטח של חלקיקים נוקשה לסנתז aAPC. מבחינה היסטורית, aAPC היה מפוברק ממגוון רחב של חומרים, כולל פוליסטירן4,5 ו ברזל לתוספי6. מערכות חדשות לנצל פולימרים מתכלים כמו פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) כדי ליצור aAPC זה יכול להיות משולב בקלות כדי לאותת חלבונים מתאימים עבור ניהול ישיר ויוו, יכול להקל על שחרורו מתמשכת של אנקפסולציה ציטוקינים או גורמים מסיסים להעצמת תא T-הפעלה-7,–8.
בנוסף נוכחותם של חלבונים הדרושים אות, אירוסין קולטן על פני שטח גדול מספיק במהלך האינטראקציה תא aAPC/T חיוני להפעלת תא T. לפיכך, פרמטרים פיזיים של aAPC כגון גודל וצורה באופן דרסטי לשנות תחום הקשר הזמינים, להשפיע על יכולתם לעורר תאי T. AAPC בגודל מיקרון הוכחו להיות יעילים יותר על תאי T מגרה מאשר שלהם הננומטרי עמיתיהם9,10. עם זאת, ננו-aAPC יכול להיות מעולה biodistribution ניקוז טוב יותר אל בלוטות הלימפה עשוי המשפרים את ביצועי ויוו מיקרו-aAPC11. צורה זו היא משתנה אחר עניין במערכות aAPC מבוסס חלקיק. AAPC אניסוטרופי לאחרונה הוכחו להיות יעיל יותר מאשר חלקיקים איזוטרופיות על תאי T מגרה, בעיקר עקב אינטראקציה משופרת עם תאי המטרה בשילוב עם תאים שאינם ספציפיים מופחתת ספיגת. תאים מעדיפים לאגד לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי, ולאפשר רדיוס גדול יותר של עקמומיות, משטח שטוח יותר קשר בין aAPC לבין תא T12. לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי מרתיעה גם phagocytosis, וכתוצאה מכך זמן מחזור הדם מוגברת בהשוואה חלקיקי כדורית בעקבות ויוו המינהל12,13. בגלל יתרונות אלה, חלקיקים אליפסואידי לתווך הרחבה יותר של אנטיגן ספציפי T תאים במבחנה וב ויוו בהשוואה חלקיקי כדורית, אפקט נצפו על מיקרו והן nanoscales12, 13. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לבדות חלקיקים אנאיזוטרופי, אבל סרט דק מתיחה היא שיטה פשוטה, נפוצה ומקובלת המשמש ליצירת מגוון צורות מגוונות של חלקיקים14. בעקבות סינתזה, חלקיקים הם הטלת לסרטים, נמתח בממדים אחד או שניים בטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר זכוכית של החומר חלקיקים. הסרט ואז התפרקה כדי לאחזר את החלקיקים. למרות גוברת ההתעניינות חלקיקים אנאיזוטרופי, לגישות עבור aAPC מבוסס חלקיק שמפברק מוגבלים בעיקר למערכות איזוטרופיות, שיטות של שינוי צורה חלקיק יכול להיות קשה ליישום, תואם מסוימים סינתזה aAPC אסטרטגיות, חוסר דיוק, הפארמצבטית15. הטכניקה מתיחה שלנו סרט דק ניתן לבצע באופן ידני או באופן אוטומטי ליצירת חלקיקים אניסוטרופי מסונתז ממגוון רחב של פולימרים מתכלים במהירות, נמתח יחס רוחב-גובה הרצויה ממדים של אחד או שניים-15.
בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, פיתחנו בגישה מבוסס חלקיק חומר מתכלה בשילוב עם טכנולוגיה מדרגיים של מתיחה סרט דק כדי ליצור במהירות aAPC עם tunable גודל וצורה בצורה סטנדרטית עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו. האסטרטגיה שלנו ההטיה חלבון יכול לשמש זוג protein(s) בכל עניין לקבוצות carboxyl על פני השטח של חלקיקים-צפיפות הרצוי, נותן את המערכת aAPC רמה גבוהה של גמישות. אנו מתארים גם שיטות כדי לאפיין את גודל, מורפולוגיה, ואת התוכן של aAPC הדם, וכן להעריך את הפונקציונליות במבחנה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להרחיב תאים חיסוניים שמחוץ או ויוו למגוון רחב של יישומים immunotherapeutic.
פרוטוקול זה מפרט שיטה רב-תכליתי לדור מדויק של חלקיקים פולימרים אנאיזוטרופי. הסרט דק מותח בטכניקה המתוארת כאן היא מדרגית, לשחזור וזולה מאוד. טכניקות חלופיות ליצירת חלקיקים אניסוטרופי סובלים מגבלות רבות, כולל עלות גבוהה, תפוקה נמוכה, גודל החלקיקים מוגבלת. הסרט דק מותח הגישה גם יתרון כי החלק?…
The authors have nothing to disclose.
EBA (DGE-1746891), KRR (DGE-1232825) תודה התוכנית NSF מלגת מחקר לתארים מתקדמים לקבלת תמיכה. רם תודה את נבחרת מחקר שירות פרס NIH NCI F31 (F31CA214147), הגמול הישג עבור מכללת אחווה מדענים לקבלת תמיכה. המחברים תודה NIH (R01EB016721 ו- R01CA195503), מחקר כדי למנוע עיוורון ג’יימס ופרס קרול חינם זרז, ו מכון בלומברג-קימל JHU על חיסוני סרטן לקבלת תמיכה.
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |