Summary

تصنيع متباين مستضد الاصطناعية البوليمر عرض خلايا CD8 + تي خلية التنشيط

Published: October 12, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكول بسرعة وتكاثر توليد مستضد أرتيسيفيكال القابلة للتحلل بيولوجيا من وحي، وعرض الخلايا (آبك) مع الانضباطي الحجم والشكل والعرض التقديمي البروتين السطحي للخلية T التوسع السابقين فيفو أو الحية .

Abstract

مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) منصة واعدة للتحوير المناعي نظراً لقدرتها القوية لتحفيز خلايا تي. ركائز اللاخلوي توفر مزايا رئيسية على aAPC يستند إلى الخلية، بما في ذلك مراقبة دقيقة لمعلمات عرض الإشارات والخصائص الفيزيائية لسطح آبك تعدل تفاعلاته مع خلايا تي. آبك مصنوع من جسيمات متباين، جسيمات ارتفاعات خاصة، قد ثبت أن يكون أكثر فعالية من نظرائهم كروية في تحفيز خلايا تي بسبب زيادة الربط وأكبر من المساحة المتوفرة للخلية T الاتصال، كذلك كما أن انخفاض الإقبال غير محدد وتعزيز خصائص الحرائك الدوائية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بالجسيمات متباين، مقبولة على نطاق واسع حتى أساليب توليد جسيمات متباين مثل تمتد غشاء رقيق يمكن أن يكون تحديا لتنفيذ واستخدام تكاثر.

وتحقيقا لهذه الغاية، وصف بروتوكول لتصنيع سريع وموحد للتحلل aAPC المستندة إلى الجسيمات متباين مع الانضباطي الحجم، الشكل، وإشارة العرض التقديمي لخلية تي توسع السابقين فيفو أو في فيفو، جنبا إلى جنب مع أساليب تميز حجمها ومورفولوجيا، والبروتين السطحي المحتوى، وتقييم الوظائف الخاصة بهم. هذا النهج إلى اختﻻق aAPC متباين للتحجيم واستنساخه، مما يجعله مثاليا لتوليد آبك إيمونوثيرابيس “الجاهزة للاستخدام”.

Introduction

مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) أظهرت الوعد كوكلاء immunomodulatory نظراً لأنها يمكن أن تولد استجابة قوية محددة مستضد T خلية. الأساسية لهذه الأنظمة الأساسية هي قدرتها على كفاءة تقديم إشارات حاسمة لتنشيط الخلية T. AAPC اللاخلوي بديل جذاب ليستند إلى الخلية آبك لأنها أسهل وأقل تكلفة اختﻻق وتواجه تحديات أقل أثناء الصعود والترجمة، والتخفيف من المخاطر المرتبطة بالعلاجات المستندة إلى الخلية. AAPC اللاخلوي تسمح أيضا بدرجة عالية من السيطرة على إشارة عرض المعلمات والخصائص الفيزيائية للسطح التي سوف تتفاعل مع خلايا تي1.

يجب أن الخص آبك على الأقل ضرورية لتنشيط الخلية تي إشارتين. إشارة 1 يوفر الاعتراف مستضد ويحدث عندما تسلم مستقبلات خلية تي (تكر) ويشترك مع فئة MHC I أو II تحمل مستضد المشابهة لها، بلغت ذروتها في إشارة عن طريق تكر المعقدة. لتجاوز شرط التحديد مستضد، نظم aAPC غالباً ما تتحمل جسم [مونوكلونل] ناهضة ضد مستقبلات CD3، الذي يحفز المجمع تكر نونسبيسيفيكالي. المؤتلف أشكال MHC، لا سيما مولتيميرس MHC، استخدمت أيضا على سطح آبك لتوفير خصوصية مستضد2،3. هو إشارة 2 إشارة كوستيمولاتوري أن يوجه نشاط الخلايا T. توفير كوستيموليشن اللازمة لتنشيط الخلية T، هو حفز مستقبلات CD28 عموما مع جسم ناهضة عرضت على السطح آبك، على الرغم من أن مستقبلات كوستيمولاتوري أخرى مثل 4-1BB كانت مستهدفة بنجاح4. يتم عادة المعطل تداولها البروتينات إشارة 1 و 2 على سطح جسيمات صلبة توليف آبك. تاريخيا، وقد كانت ملفقة aAPC من مجموعة متنوعة من المواد، بما في ذلك البوليستيرين4،5 والحديد ديكستران6. استخدام أحدث أنظمة البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي مثل بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا) لتوليد آبك التي يمكن بسهولة إضافة إلى إشارة البروتينات وهي مناسبة للإدارة المباشرة في فيفو، ويمكن تسهيل الإفراج عن المطرد تغليف السيتوكينات أو العوامل القابلة للذوبان لزيادة تنشيط الخلية تي7،8.

بالإضافة إلى وجود بروتينات الإشارات الضرورية، مشاركة مستقبلات على مساحة كبيرة بما فيه الكفاية خلال التفاعل خلية آبك/T ضروري لتنشيط الخلية T. وهكذا، البارامترات الفيزيائية ل aAPC مثل الحجم والشكل جذريا يغير مجال الاتصال المتاحة ويؤثر على قدرتها على حفز خلايا تي. أظهرت aAPC ميكرون الحجم لتكون أكثر فعالية في تحفيز خلايا تي من9،النظراء النانو على10. ومع ذلك، يمكن أن يكون نانو-آبك بيوديستريبوشن متفوقة وأفضل الصرف إلى الغدد الليمفاوية التي يمكن أن تعزز بها الأداء في فيفو أكثر من الصغرى-آبك11. الشكل متغير آخر للفائدة في النظم المستندة إلى الجسيمات آبك. مؤخرا أظهرت aAPC متباين يكون أكثر فعالية من الجسيمات الخواص في تحفيز خلايا تي، يرجع ذلك أساسا إلى تعزيز التفاعل مع الخلايا الهدف مقترنا مع الخلية غير محددة انخفاض الإقبال. ربط خلايا تفضيلي المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات، وأكبر نصف قطر انحناء سطح تملق والسماح لمزيد من الاتصال بين أعبك وخلية T12. كما يثبط المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات البلعمه، أسفر عن وقت التداول زيادة مقارنة بجسيمات كروية بعد في فيفو الإدارة12،13. وبسبب هذه المزايا، التوسط الجسيمات ارتفاعات أكبر توسع محددة مستضد تي الخلايا في المختبر و في فيفو مقارنة بجسيمات كروية، لاحظ تأثير في الجزئي ونانوسكاليس12، 13. وهناك استراتيجيات مختلفة لاختلاق الجسيمات متباين، ولكن تمتد غشاء رقيق أسلوب بسيط ومقبول على نطاق واسع تستخدم لتوليد مجموعة من الجسيمات المتنوعة الأشكال14. بعد التوليف، ويلقي في الأفلام الجسيمات وامتدت في أبعاد واحد أو اثنين في درجة حرارة فوق درجة حرارة التحول الزجاجي للمواد الجسيمات. ثم يتم حل الفيلم لاسترداد الجسيمات. وعلى الرغم من تزايد الاهتمام في جزيئات متباين، النهج الحالي لتصنيع آبك على أساس الجسيمات في معظمها تقتصر على نظم الخواص، وأساليب تغيير الشكل الجسيمات يمكن أن تكون صعبة التنفيذ، غير متوافقة مع بعض التوليف aAPC استراتيجيات، والافتقار إلى الدقة وإمكانية تكرار نتائج15. لدينا تقنية تمتد من غشاء رقيق يمكن تنفيذها يدوياً أو بطريقة إليه لسرعة توليد متباين الجزيئات توليفها من مجموعة متنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، امتدت إلى نسبة العرض إلى الارتفاع المطلوب في واحد أو اثنين من أبعاد15.

يستند عملنا السابق، قمنا بتطوير نهج قائم على الجسيمات القابلة للتحلل الحيوي جنبا إلى جنب مع تقنية تمتد غشاء رقيق تحجيم سرعة توليد aAPC مع الانضباطي الحجم والشكل بطريقة موحدة للخلية T التوسع السابقين فيفو أو في فيفو. يمكن استخدام استراتيجيتنا تصريف البروتين لزوجين protein(s) أي اهتمام لمجموعات الكربوكسيل على سطح الجسيمات في كثافة المرجوة، يعطي هذا النظام آبك بدرجة عالية من المرونة. كما يصف لنا طرق لوصف حجم ومورفولوجيا، والمحتوى من آبك سطح البروتين، وتقييم تلك الوظائف في المختبر. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لتوسيع نطاق الخلايا المناعية السابقين فيفو أو في فيفو لمجموعة متنوعة من التطبيقات إيمونوثيرابيوتيك.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا “رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز. 1-تصنيع جسيمات كروية بلجا لحجم الانضباطي إعداد مواد تخليق الجسيمات إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل. إضافة 500 مل مياه (DI) إلى قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة ?…

Representative Results

ويرد في الشكل 1تخطيطي للألى 2D رقيقة تمتد الجهاز. ويرد في هو et al.17 نقالة يتكون من أجزاء الألومنيوم استخدام التفريز القياسية وتقنيات القطع التخطيطي، ووصف لطبقة رقيقة 1 د تمتد الجهاز. مماثلة على نقالة د 1، نقالة 2D يتكون من قبضة معدنية والقضبان دلي?…

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول وسيلة مرنة لتوليد جزيئات البوليمر متباين دقيقة. رقيقة تمتد التقنية المذكورة هنا قابلة للتطوير وعالية استنساخه وغير مكلفة. تقنيات بديلة لتوليد جزيئات متباين يعاني من قيود كثيرة، بما في ذلك تكلفة عالية ومنخفضة الإنتاجية، وحجم الجسيمات محدودة. رقيقة تمتد النهج هو أيض?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ما عدا (DGE-1746891) وكر (DGE-1232825) شكرا برنامج “زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني” للدعم. ذاكرة الوصول العشوائي وذلك بفضل الوطنية البحوث جائزة المعاهد الوطنية للصحة خدمة F31 NCI (F31CA214147) و “مكافآت الإنجاز” “زمالة علماء الكلية” للدعم. يشكر المؤلفون المعاهد الوطنية للصحة (R01EB016721 و R01CA195503)، والبحوث لمنع العمى جيمس وجائزة محفز حرة كارول، ومعهد “السرطان العلاج المناعي” لدعم بلومبرغ-كيميل الرهبان.

Materials

Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

References

  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Play Video

Cite This Article
Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

View Video