Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .
Abstract
Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) zijn een veelbelovende platform voor immuun modulatie vanwege hun krachtige vermogen te stimuleren van T-cellen. Acellulair substraten bieden belangrijke voordelen ten opzichte van cel-gebaseerde aAPC, met inbegrip van nauwkeurige controle van signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak van de aAPC om te differentiëren van de interacties met T-cellen. aAPC opgebouwd uit anisotrope deeltjes, met name ellipsvormige deeltjes, is gebleken dat effectiever dan hun sferische tegenhangers op stimulerende T cellen als gevolg van verhoogde bindende en grotere oppervlakte beschikbaar voor T cel contact, evenals opnemen verminderd als niet-specifieke opname- en verbeterde farmacokinetische eigenschappen. Ondanks de toegenomen belangstelling voor anisotropische deeltjes, zelfs geaccepteerd methoden voor het genereren van anisotrope deeltjes zoals dunne-film uitrekken kan lastig zijn te implementeren en te gebruiken reproducibly.
Te dien einde, we beschrijven een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde fabrikatie van biologisch afbreekbare anisotrope deeltje gebaseerde aAPC met afstembare grootte, vorm, en signaal presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo, samen met methoden om te karakteriseren van hun grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud, en te beoordelen hun functionaliteit. Deze aanpak voor het fabriceren van anisotrope aAPC is schaalbaar en reproduceerbaar is, waardoor hij ideaal is voor het genereren van aAPC voor ‘off-the-shelf’ immuuntherapie.
Introduction
Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) is gebleken belofte als immunomodulerende agenten omdat ze een robuuste antigeen-specifieke T cel-reactie kunnen genereren. Essentieel voor deze platforms zijn hun mogelijkheid om efficiënt cruciale signalen voor T-cel activatie. Acellulair aAPC zijn een aantrekkelijk alternatief voor cel-gebaseerde aAPC, omdat ze gemakkelijker en goedkoper te fabriceren, minder uitdagingen tijdens schaalvergroting en vertaling, en risico’s van cel-gebaseerde therapieën te verlichten. Acellulair aAPC is ook voorzien van een hoge mate van controle over signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak zal interfacecomponenten met T cellen1.
aAPC moet een minimum van twee signalen essentieel voor T-cel activatie recapituleren. Signaal 1 biedt antigeen erkenning en treedt op wanneer de T cel receptor (TCR) herkent en houdt zich bezig met een MHC klasse I of II, rekening houdend met zijn cognaat antigeen, culminerend in de signalering via de TCR complexe. Om te omzeilen het vereiste antigeen specificiteit, dragen aAPC systemen vaak een agonistic monoklonaal antilichaam tegen de CD3 receptor, dat nonspecifically de TCR-complex stimuleert. Recombinante vormen van MHC, met name MHC multimeren, hebben ook gebruikt op het oppervlak van aAPC antigeen specificiteit2,3. Signaal 2 is een costimulatory signaal dat T cel activiteit regisseert. Om de costimulatie die nodig zijn voor de T-cel activatie, wordt de CD28 receptor in het algemeen gestimuleerd met een agonistic antilichaam gepresenteerd op het oppervlak van de aAPC, hoewel andere costimulatory receptoren zoals 4-1BB met succes gerichte4 geweest. Signaal 1 en 2 eiwitten zijn meestal geïmmobiliseerd op het oppervlak van stijve deeltjes te synthetiseren van aAPC. Historisch gezien hebben aAPC is vervaardigd uit een verscheidenheid aan materialen, met inbegrip van polystyreen4,5 en ijzer dextran6. Nieuwere systemen gebruiken biologisch afbreekbare polymeren zoals poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) voor het genereren van aAPC die gemakkelijk kan worden gekoppeld om aan te geven van eiwitten, geschikt voor directe toediening in vivo, en kan vergemakkelijken de aanhoudende release van ingekapseld cytokines of oplosbare factoren om uit te breiden van T cel activatie7,8.
Naast de aanwezigheid van eiwitten van de nodige signaal is betrokkenheid van de receptor over een voldoende groot oppervlak tijdens de interactie die aAPC/T cel essentieel voor T-cel activatie. Fysieke parameters van de aAPC zoals grootte en vorm drastisch veranderen hun beschikbare contactpunten en dus invloed hebben op hun vermogen te stimuleren van T-cellen. Micron en middelgrote aAPC gebleken om meer effectief op stimulerende T-cellen dan hun nanoschaal tegenhangers9,10. Nano-aAPC kan echter superieur ook en betere afvoer naar de lymfeklieren die hun prestaties in vivo over micro-aAPC11 verbeteren kunnen. Vorm is een andere variabele van belang in aAPC deeltje gebaseerde systemen. Anisotrope aAPC hebben onlangs aangetoond dat effectiever dan isotrope deeltjes op stimulerende T-cellen, voornamelijk als gevolg van verbeterde interactie met de doelcellen in combinatie met verminderde aspecifieke cel opname. Cellen bij voorkeur binden aan de lange as van de ellipsvormige deeltjes, en de grotere straal van kromming en platter oppervlak zorgen voor meer contact tussen de aAPC en de T cel12. De lange as van de ellipsvormige deeltjes ook ontmoedigt fagocytose, wat resulteert in verhoogde omloop tijd in vergelijking met bolvormige deeltjes na in vivo administratie12,13. Vanwege deze voordelen bemiddelen ellipsvormige deeltjes grotere uitbreiding van antigeen-specifieke T cellen in vitro en in vivo in vergelijking met bolvormige deeltjes, een effect waargenomen bij zowel de micro- en nanoscales12, 13. Er zijn verschillende strategieën te fabriceren anisotrope deeltjes, maar dunne-film uitrekken zich is een eenvoudige, algemeen aanvaarde methode gebruikt voor het genereren van een aantal uiteenlopende particle vormen14. Na de synthese, zijn de deeltjes in films geworpen en uitgerekt in één of twee dimensies bij een temperatuur boven de temperatuur van de overgang glas van het deeltje materiaal. De film wordt dan opgelost om op te halen van de deeltjes. Ondanks de groeiende belangstelling voor anisotropische deeltjes, kunnen huidige benaderingen voor vervaardigen deeltje gebaseerde aAPC zijn meestal beperkt tot isotrope systemen en methoden voor het wijzigen van de particle shape moeilijk uit te voeren, onverenigbaar is met de synthese van bepaalde aAPC strategieën, en gebrek aan nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid15. Onze uitrekkende techniek van dunne-film kan handmatig worden uitgevoerd of op een geautomatiseerde wijze snel genereren anisotrope deeltjes uit een verscheidenheid van biologisch afbreekbare polymeren gesynthetiseerd, uitgerekt tot een gewenste hoogte-breedteverhouding in één of twee afmetingen15.
Op basis van onze eerdere werk, ontwikkeld we een biologisch afbreekbaar deeltje gebaseerde aanpak in combinatie met schaalbare dunne-film uitrekkende technologie om snel genereren aAPC met regelbare grootte en vorm op een gestandaardiseerde manier voor T cel expansie ex vivo of in vivo. Onze eiwit-vervoeging-strategie kan worden gebruikt voor elke expressie gebrachte eiwitten van belang aan carboxylgroepen op het oppervlak van de deeltjes op een gewenste dichtheid, een hoge mate van flexibiliteit te geven aan dit aAPC-systeem koppelen. Ook beschrijven we methoden voor het karakteriseren van de grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud van aAPC, en hun functionaliteit in vitrote evalueren. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden aan immuuncellen ex vivo of in vivo voor allerlei immunotherapeutische toepassingen uit te breiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol gegevens een veelzijdige methode voor de precieze generatie anisotrope polymere deeltjes. De dunne film techniek hier beschreven uitrekken is schaalbaar, zeer reproduceerbaar en goedkoop. Alternatieve technieken voor het genereren van anisotrope deeltjes lijden veel beperkingen, met inbegrip van de hoge kosten, lage doorvoersnelheid en beperkte deeltjesgrootte. De dunne film uitrekken aanpak is ook gunstig omdat de deeltjes zijn aangepast om anisotrope na synthese en, dientengevolge, is compatibel met een br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank de NSF Graduate Research Fellowship-programma voor steun EBA (DGE-1746891) en KRR (DGE-1232825). RAM bedankt de nationale onderzoek Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) en de Achievement beloningen voor College wetenschappers Fellowship voor steun. De auteurs bedanken de NIH (R01EB016721 en R01CA195503), het onderzoek te voorkomen blindheid James en Carole gratis katalysator Award, en de JHU Bloomberg-Kimmel Instituut voor kanker immunotherapie voor ondersteuning.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
