Summary

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 07, 2018
doi:

Summary

Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

Abstract

Transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda ocurre de vez en cuando, especialmente cuando las personas que manejan alimentos y agua están infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. El método estándar de oro para la detección de Salmonella spp./Shigella spp es cultura directa pero esto es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para Salmonella spp./Shigella spp de detección, usando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) combinada con cultura guiada. Hay dos etapas principales: la cultura guiada y PCR en tiempo real. Para la primera etapa (PCR en tiempo real), se explica cada paso del método: la muestra recogida, previo enriquecimiento, extracción de ADN y PCR en tiempo real. Si el resultado PCR en tiempo real es positivo, entonces se realiza la segunda etapa (cultura guiada): cultivo selectivo, identificación bioquímica y serológica caracterización. También ilustramos resultados representativos generados de él. El protocolo descrito aquí sería una plataforma valiosa para la detección rápida, específica, sensible y de alto rendimiento de Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

La diarrea es aún un problema de salud común con una incidencia alta tasa global1,2. Aunque la mortalidad es relativamente baja, algunos pacientes muestran varios síntomas durante semanas (por ejemplo, las heces blandas y acuosas, una urgencia para ir al baño), que hacen que el impacto socioeconómico muy alto3,4. Más grave aún, algunos pacientes incluso pueden desarrollar síndrome de intestino irritable si se deja sin tratar5. Hay varias clases de bacterias, virus y parásitos que pueden causar diarrea6. Salmonella sppShigella spp., están entre las bacterias más comunes para la transmisión de la gastroenteritis aguda7,8,9,10,11. Por lo tanto, muchos condados han emitido leyes o reglamentos para regular spp Salmonella /Shigella spp. cribado entre las personas que se manejan alimentos y agua. Por ejemplo, el gobierno chino ha emitido leyes para obligatorio Salmonella spp. /Shigella spp. de detección una vez al año.

El método estándar de oro para Salmonella spp. / detección deShigella spp es la cultura de las bacterias. A través de bacterias cultura y sucesiva identificación bioquímica y serológica caracterización, podemos identificar las especies de bacterias, lo que podrían facilitar la gestión del brote de la enfermedad y perfiles de antimicrobianos para el tratamiento de pacientes 12. también podría ayudar a rastrear el origen de la infección durante la Salmonella spp. /Shigella spp. brote13. Sin embargo, este método es intensiva (que requieren operación manual) y lento (tomando varios días), especialmente para la prueba de un gran número de muestras7. Por otra parte, viable pero no cultivable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spppueden existir en algunas muestras de heces14. En vista de estos inconvenientes, muchos laboratorios han tratado de desarrollar nuevas técnicas para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos estos métodos utilizan la prueba de amplificación de ácido nuclear (NAAT), entre los que la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es la más común. Una limitación importante de estos métodos NAAT base es que las bacterias muertas, bacteriana incluso ruina que contiene ADN genómico incompleta, podrían demostrar resultados positivos26, que podrían influir en gran medida el diagnóstico preciso de la enfermedad. Blanco et al demostró que análisis molecular es altamente sensible, no sólo viable Salmonella en culturas, pero también a genomas parciales y bacterias muertas o inviables de infecciones pasadas o contaminación26. Por lo tanto, se deben desarrollar nuevas tecnologías.

Aquí, describimos un nuevo método que combina el NAAT basado en método y cultivo. Como se muestra en la figura 1, este nuevo método aplica a PCR en tiempo real detección primero y luego se envían muestras positivas para la identificación y cultivo de bacterias.

Protocol

El protocolo sigue los lineamientos establecidos por el Comité de ética de investigación de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Utilice estándar operación estéril durante el experimento. 1. preparación y composición de los medios de cultivo Preparar el caldo nutritivo: Disolver la peptona 1%, extracto de carne de res de 0.3%, cloruro de sodio 0,5%, glucosa 0.1% en H2O, ajustar el pH a 7,5 y autoclave en 121 ° C durante 15 minutos. Preparar med…

Representative Results

Se aplicó el protocolo para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp en heces anal muestras de personas que se manejan alimentos y agua. En el paso de la PCR en tiempo real, como se muestra en la figura 5A, hubo una amplificación exitosa en canal HEX, que significó que la muestra mezclada era positiva para Salmonella spp. Luego se realizó una PCR…

Discussion

Desde Salmonella sppShigella spp. a menudo se asocian a la intoxicación alimentaria y transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda28,29 y el método de rutina es desperdiciador de tiempo o mano de obra intensiva 7, se describe una plataforma de alto rendimiento para la Salmonella spp. / detección deShigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la ciencia y tecnología programa de Zhuhai, China (concesión número 20171009E030064), la ciencia y tecnología programa de Guangdong, China (concesión número 2015A020211004) y ciencia y programa de Administración General de tecnología de supervisión de calidad, inspección y cuarentena de la República Popular de China (número de concesión 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

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Cite This Article
Yang, Z., Chen, X., Tu, C., Su, Y., Wang, H. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

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