Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp. /Shigella spp. zijn gemeenschappelijke ziekteverwekkers toegeschreven aan diarree. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. PCR in real time te gebruiken in combinatie met begeleide cultuur.
Abstract
Fecaal-orale transmissie van acute gastro-enteritis gebeurt van tijd tot tijd, vooral wanneer mensen behandeld voedsel en water zijn besmet door Salmonella spp.,/Shigella spp. De methode van de gouden standaard voor het opsporen van Salmonella spp.,/Shigella spp. is directe cultuur, maar dit is arbeidsintensief en tijdrovend. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor Salmonella spp./Shigella spp. screening, met behulp van real-time polymerasekettingreactie (PCR) in combinatie met begeleide cultuur. Er zijn twee belangrijke fasen: PCR in real time en de begeleide cultuur. Voor de eerste fase (real-time PCR), leggen we elke stap van de methode: proeven collectie, vóór verrijking, DNA-extractie en PCR in real time. Als de real-time PCR-resultaat positief is, dan de tweede fase (begeleide cultuur) wordt uitgevoerd: selectieve cultuur, biochemische identificatie en karakterisering van de serologische. We illustreren ook representatieve resultaten gegenereerd op basis van het. Het protocol beschreven hier zou een waardevol platform voor de snelle, specifieke, gevoelige en high-throughput screening van Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Diarree is nog steeds een gemeenschappelijk probleem voor de volksgezondheid met een hoge incidentie tarief wereldwijd1,2. Hoewel de sterfte relatief laag is, sommige patiënten tonen verschillende symptomen voor weken (zoals losse en waterige ontlasting, een urgentie te gaan naar de badkamer), waardoor de socio-economische impact zeer hoog3,4. Erger nog, sommige patiënten kunnen zelfs het ontwikkelen van Prikkelbare darmsyndroom indien verlaten onbehandeld5. Er zijn verschillende soorten bacteriën, virussen en parasieten die leiden diarree6 tot kunnen. Salmonella spp. /Shigella spp. behoren tot de meest voorkomende bacteriën voordeoverdracht van acute gastro-enteritis7,8,9,10,11. Daarom veel provincies hebben afgegeven wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen voor regelmatige Salmonella spp. /Shigella spp. screenen bij mensen die voedsel en water zou behandelen. Bijvoorbeeld, de Chinese regering wetten voor verplichte Salmonella spp. hebben uitgegeven /Shigella spp. screening eenmaal per jaar.
De methode van de gouden standaard voor Salmonella spp. /Shigella spp. detectie is bacteriën cultuur. Door bacteriën cultuur en opeenvolgende biochemische identificatie en serologische karakterisatie, kunnen we identificeren van de soorten van bacteriën, die zou kunnen vergemakkelijken, beheer van de uitbraak van de ziekte en antimicrobiële profiling steun van de behandeling van patiënten 12. het kan ook helpen met het traceren van de bron van besmetting tijdens de Salmonella spp. /Shigella spp. uitbraak13. Deze methode is echter arbeidsintensieve (vereisen handmatige bediening) en tijdrovend (rekening met enkele dagen), met name voor het testen van grote aantallen monsters7. Bovendien, levensvatbare maar niet-culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kunnen bestaan in sommige kruk monsters14. Met het oog op deze nadelen, veel laboratoria hebben geprobeerd te ontwikkelen van nieuwe technieken voor het opsporen van Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. al deze methoden gebruiken de nucleaire zure amplificatie test (NAAT), waaronder de polymerase-kettingreactie (PCR) de meest voorkomende is. Een belangrijke beperking van deze methoden NAAT gebaseerd is dat dode bacteriën, zelfs bacteriële puin met onvolledige genomic DNA, kon laten zien positieve resultaten26, die grotendeels de accurate diagnose van de ziekte kunnen beïnvloeden. Blanco et al. toonde dat moleculaire assay is hoogst-gevoelig, niet alleen voor levensvatbare Salmonella in culturen, maar ook voor gedeeltelijke genomen en dode of niet-levensvatbare bacteriën uit verleden infecties of besmetting26. Daarom moet nieuwe technologie worden ontwikkeld.
We beschreven hier, een nieuwe methode dat combineert de NAAT gebaseerd methode en kweken. Zoals blijkt uit Figuur 1, deze nieuwe methode geldt screening van de eerste PCR in real time en dan positieve monsters voor bacteriën cultuur en identificatie worden verzonden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinds Salmonella spp. /Shigella spp. worden vaak geassocieerd met voedselvergiftiging en faecale-orale overdracht van acute gastro-enteritis28,29 en de gebruikelijke methode is arbeidsintensief of tijdrovende 7, beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de Salmonella spp. /Shigella spp. screening, met behulp van PCR in real time gecombineerd met begeleide cultuur.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de wetenschap en technologie programma van Zhuhai, China (subsidie nummer 20171009E030064), de wetenschap en technologie programma van Guangdong, China (subsidie nummer 2015A020211004) en de wetenschap en technologie programma van General Administration van Quality Supervision, Inspection and Quarantine van de Volksrepubliek China (subsidie nummer 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
