Summary

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 07, 2018
doi:

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Abstract

Transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda ocorre de vez em quando, especialmente quando pessoas que cuidou de comida e água são infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. O método padrão-ouro para a detecção de Salmonella spp./Shigella spp. é cultura direta mas é trabalhosa e demorada. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para Salmonella spp./Shigella spp. triagem, usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) combinada com cultura guiada. Há duas fases principais: a cultura guiada e PCR em tempo real. Para a primeira fase (PCR em tempo real), vamos explicar cada passo do método: coleção, pré-enriquecimento, extração de DNA e PCR em tempo real da amostra. Se o resultado PCR em tempo real é positivo e, em seguida, é realizada a segunda fase (cultura guiada): seletiva cultura, identificação bioquímica e sorológica caracterização. Ilustraremos também resultados representativos gerados a partir dele. O protocolo descrito aqui seria uma plataforma valiosa para a seleção rápida, específica, sensível e elevado-throughput de Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Diarreia é ainda um problema de saúde comum com uma incidência elevada taxa globalmente1,2. Embora a mortalidade é relativamente baixa, alguns pacientes apresentam sintomas de várias semanas (por exemplo, solta e aguadas fezes, urgência para ir ao banheiro), que tornam o impacto sócio-econômico muito alta3,4. Mais a sério, alguns pacientes podem desenvolver até mesmo síndrome do intestino irritável se deixados sem tratamento5. Existem vários tipos de bactérias, vírus e parasitas que podem causar diarreia6. Salmonella spp. /Shigella spp. estão entre as bactérias mais comuns para a transmissão de gastroenterite aguda7,8,9,10,11. Portanto, muitos condados emitiram leis ou regulamentos para regular Salmonella spp / triagem deShigella spp. entre as pessoas que iria lidar com comida e água. Por exemplo, o governo chinês emitiu leis para obrigatório Salmonella spp / triagem deShigella spp. uma vez por ano.

O método padrão-ouro para Salmonella spp. / deteção deShigella spp. é a cultura de bactérias. Através de cultura de bactérias e sucessiva identificação bioquímica e sorológica caracterização, podemos identificar as espécies de bactérias, que podem facilitar a gestão do surto de doença e antimicrobiana de perfil para auxiliar o tratamento de pacientes 12. pode também ajudar localizar a fonte de infecção durante a Salmonella spp. /Shigella spp. surto13. No entanto, este método é trabalhosa (que exigem operação manual) e demorado (leva vários dias), especialmente para os testes de um grande número de amostras7. Além disso, viável mas não-viáveis (VBNC) Salmonella spp /pode existir em algumas amostras de fezesdeShigella spp.14. Tendo em conta essas desvantagens, muitos laboratórios tentaram desenvolver novas técnicas para a detecção de Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos esses métodos usam o teste de amplificação de ácido nuclear (NAAT), entre os quais a reação em cadeia do polymerase (PCR) é o mais comum. Uma grande limitação destes métodos NAAT baseado é que bactérias mortas, detritos mesmo bacteriana contendo incompleta DNA genômico, poderiam mostrar resultados positivos,26, que em grande parte poderia influenciar o diagnóstico preciso da doença. Blanco et al mostrou que aquele ensaio molecular é altamente sensível, não só viável salmonelas nas culturas, mas também para genomas parciais e bactérias mortas ou inviáveis de infecções passadas ou contaminação26. Portanto, a nova tecnologia deve ser desenvolvida.

Aqui, descrevemos um método inovador que combina o NAAT baseado método e cultivo. Como mostrado na Figura 1, este novo método se aplica a PCR em tempo real, triagem primeiro e em seguida as amostras positivas são enviadas para a identificação e a cultura de bactérias.

Protocol

O protocolo segue as orientações definidas pelo Comitê de ética de pesquisa humana de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Por favor, use o padrão operação estéril durante o experimento. 1. preparação e composição de meios de cultura Prepare o caldo de carne nutriente: Dissolver peptona 1%, 0,3% de extrato de carne, 0,5% de cloreto de sódio, 0,1% de glicose em H2O, ajustar o pH a 7,5 e autoclave em 121 ° C por 15 min. Prepare o suporte de …

Representative Results

O protocolo foi aplicado para o rastreio de Salmonella spp. / amostras deShigella spp. em fezes anal de pessoas que iria lidar com comida e água. Na etapa PCR em tempo real, como mostrado na Figura 5A, houve uma amplificação bem-sucedida no canal de HEX, o que significava que a amostra mista era positiva para Salmonella spp. Em seguida, um mais PCR em t…

Discussion

Desde Salmonella spp. /Shigella spp. são frequentemente associados com intoxicação alimentar e transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda28,29 , e o método de rotina é trabalhoso ou demorado 7, nós descrevemos uma plataforma de alta produtividade para a Salmonella spp. / rastreio deShigella spp., usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Há várias et…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela ciência e tecnologia programa de Zhuhai, China (número de concessão de 20171009E030064), a ciência e tecnologia programa de Guangdong, China (número de concessão de 2015A020211004) e da ciência e tecnologia-programa de administração geral Supervisão da qualidade, inspeção e quarentena da República Popular da China (número de concessão de 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

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Cite This Article
Yang, Z., Chen, X., Tu, C., Su, Y., Wang, H. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

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