פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.
Summary
סלמונלה spp /שיגלה spp. הם נפוצים פתוגנים לייחס שלשול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.
Abstract
מחזור צואה-פה שידור של להרעלתו חריפה מתרחשת מפעם לפעם, במיוחד כאשר אנשים שטיפל מזון ומים נגועים על ידי סלמונלה spp/Shigella spp. שיטת תקן זהב עבור הגילוי של סלמונלה spp/Shigella spp. היא תרבות ישירה אבל זו שדורשת ולגזול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה עבור/Shigella spp. סלמונלה spp ההקרנה, משתמש בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) בשילוב עם תרבות מודרכים. ישנם שני שלבים עיקריים: בזמן אמת PCR ותרבות מודרכים. השלב הראשון (PCR בזמן אמת), להסביר כל שלב של השיטה: לטעום אוסף, העשרה קדם, מיצוי DNA ו- PCR בזמן אמת. התוצאה PCR בזמן אמת היא חיובית, אם מתבצע השלב השני (תרבות מודרך): תרבות סלקטיבית, הביוכימי זיהוי ואפיון סרולוגית. אנחנו גם להמחיש את התוצאות נציג שהופקו ממנה. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה פלטפורמה יקר להקרנה מהירה, ספציפית, רגיש, תפוקה גבוהה של סלמונלה spp /שיגלה spp.
Introduction
שלשול הוא עדיין בעיית בריאות משותפת עם שכיחות גבוהה שיעור כללי1,2. למרות התמותה היא נמוכה יחסית, חלק מהחולים מראים סימפטומים שונים במשך שבועות (כגון רפוי, דומעות שרפרפים, דחוף ללכת לשירותים), שהופכים את ההשפעה חברתי-כלכלי גבוה מאוד3,4. יותר ברצינות, חלק מהחולים עשויים להתפתח גם תסמונת המעי הרגיז אם אינו מטופל5. ישנם סוגים שונים של חיידקים, וירוסים, טפילים שיכולים לגרום לשלשול6. סלמונלה spp /שיגלה spp. הם בין החיידק הנפוץ ביותר להעברת להרעלתו חריפה7,8,9,10,11. לכן, מדינות רבות פרסמו חוקים או תקנות רגיל סלמונלה spp / spp.שיגלה הקרנת בקרב אנשים היה מתמודד עם מים ואוכל. לדוגמה, הממשלה הסינית פרסמו חוקים עבור חובה סלמונלה spp / spp.שיגלה הקרנה פעם בשנה.
לשיטת תקן הזהב סלמונלה sppשיגלה spp. זיהוי זה התרבות חיידקים. דרך התרבות חיידקים, רצופים הביוכימי זיהוי ואפיון סרולוגית, נוכל לזהות המינים של חיידקים, אשר יכול להקל על ניהול התפרצות המחלה והגדרת פרופיל מיקרוביאלית לסייע לטיפול בחולים 12. זה גם יכול לעזור לאתר. את מקור זיהום במהלך סלמונלה spp /שיגלה spp. התפרצות13. עם זאת, שיטה זו היא מהגידולים (דרישת ידני), זמן רב (לוקח מספר ימים), במיוחד עבור בדיקה של מספר רב של דוגמאות7. יתר על כן, מעשית אלא ללא-culturable (VBNC) סלמונלה spp /שיגלה spp.קיים בדגימות צואה14. על רקע מחסרונות אלה, מעבדות רבות ניסו לפתח טכניקות חדשות עבור הגילוי של סלמונלה spp /שיגלה spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. כל השיטות האלה השתמש במבחן הגברה חומצת הגרעין (NAAT), ביניהם תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא הנפוצה ביותר. מגבלה אחת גדולה של השיטות NAAT מבוסס הוא כי חיידקים מתים, פסולת אפילו חיידקי. DNA גנומי לא שלם המכיל, יכול להראות תוצאות חיוביות26, אשר יכלו להשפיע במידה רבה על אבחנה מדויקת של המחלה. בלאנקו. et al. הראה שאת assay מולקולרית היא רגישה מאוד, לא רק קיימא סלמונלה בתרבויות, אלא גם על חלקי הגנום, חיידקים מתים או נבאדה דלקות בעבר או זיהום26. לכן, צריך לפתח טכנולוגיה חדשה.
כאן, אנחנו תיאר שיטה זה משלב NAAT מבוססי שיטה, culturing. כפי שמוצג באיור1, שיטה חדשה חל בזמן אמת PCR ההקרנה הראשונה, לאחר מכן נשלחים דוגמאות חיוביות התרבות חיידקים וזיהוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז סלמונלה spp /שיגלה spp. הקשורים לעתים קרובות עם הרעלת מזון והעברת בצואה אורלי להרעלתו חריפה28,29 , השיטה שגרתית היא עתירי עבודה או זמן רב 7, נתאר פלטפורמה תפוקה גבוהה סלמונלה spp /שיגלה spp. ההקרנה, באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המדע, טכנולוגיה תוכנית של Zhuhai, סין (20171009E030064 מספר גרנט), המדע התוכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג, סין (2015A020211004 מספר גרנט), המדע ואת הטכנולוגיה של כללי ניהול הפרויקט של איכות הפיקוח, הביקורת ההסגר של הרפובליקה העממית של סין (2016IK302 מספר של גרנט, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
