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Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Abstract

O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.

Introduction

Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.

Ativar o ‘perigo’ sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .

Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.

Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.

Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.

Protocol

Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso. 1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados. Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas …

Representative Results

A diferenciação e seleção de BMDCs: Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de for…

Discussion

Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
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References

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Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
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