نقدم هنا، وضع بروتوكول لتطوير وتميز الخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس) وتقييم فائدتها إيمونوثيرابيوتيك.
يعمل الجهاز المناعي بالحفاظ على توازن محكم بين تنسيق الاستجابات ضد المستضدات الأجنبية والحفاظ على دولة لا تستجيب ضد المستضدات الذاتية فضلا عن المستضدات المستمدة من الكائنات الحية commensal. يمكن أن يؤدي الإخلال بهذا التوازن المناعي لالتهاب مزمن وتنمية المناعة الذاتية. الخلايا الجذعية (DCs) هي خلايا نظام المناعة الفطرية المشتركة في تنشيط الخلايا السذاجة T الشروع في الاستجابات المناعية ضد المستضدات الأجنبية عرض مستضد المهنية. ومع ذلك، وحدات تحكم المجال Dc يمكن أن تكون متباينة أيضا في تولدكس التي تعمل على الحفاظ على وتعزيز التسامح خلية تي وأن قمع خلايا المستجيب المساهمة في تطوير الأوضاع الذاتية أو المزمن التهاب أما. النهوض الأخيرة في فهمنا تولدكس يوحي بأنه يمكن تحقيق التسامح DC بتحوير ظروف التمايز. أدت هذه الظاهرة إلى النمو الهائل في تطوير علاجات تولدك للاضطرابات المناعية عديدة تسبب الواجبة لكسر في منأى عن التسامح. كذلك أقرت الدراسات الناجحة في نماذج مورين المناعة الذاتية الإكلينيكية الأداة إيمونوثيرابيوتيك من تولدكس في علاج اضطرابات المناعة الذاتية. اليوم، أصبحت تولدكس أداة إيمونوثيرابيوتيك واعدة في العيادة لإعادة المفصولين التسامح المناعي في الاضطرابات المناعية المختلفة باستهداف الاستجابات الذاتية المسببة للمرض بينما ترك حصانة وقائية سليمة. على الرغم من أن مجموعة من الاستراتيجيات اقترحه مختبرات متعددة للحث على تولدكس، لا يوجد اتساق في وصف النمط الظاهري الخلوية والوظيفية لهذه الخلايا. هذا البروتوكول يوفر دليل خطوة بخطوة لتطوير وحدات تحكم المجال Dc المشتقة من نخاع العظام بإعداد كبيرة، أسلوب فريد يستخدم للتفريق بينهم في تولدكس مع triterpenoid اصطناعية 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic حمض-ديفلورو-بروبيل-أميد (كدو-مديرة)، والتقنيات المستخدمة لتأكيد على النمط الظاهري، بما في ذلك تحليلات للتوقيعات الجزيئية الأساسية من تولدكس. وأخيراً، نحن إظهار أسلوب تقييم الدالة تولدك باختبار تلك الاستجابة المثبطة للمناعة في المختبر و في فيفو في نموذج السريرية للتصلب المتعدد.
الخلايا الجذعية (DCs) هي جزء لا يتجزأ من نظام المناعة الفطرية وأول مرة اكتشفت وتميزت رالف ستينمان وزانفيل كوهن في عام 1973 كما عرض مستضد المهنية الأولية الخلايا1. وحدات تحكم المجال Dc قد ثبت أن تلعب دوراً مهما في تنشيط محصنة بتقديم المستضدات المجهزة للخلايا T والخلايا ب عن طريق المجمعات الكبرى histocompatibility (MHC) في الأجهزة اللمفاوية الثانوية لربط نظم المناعة الفطرية وتكيفية2. في الثدييات المناعي، هناك فئتين على الأقل من وحدات تحكم المجال Dc التي وصفت بأنها النقوي وحدات تحكم المجال Dc وبلاسماسيتويد DCs (pDCs)3. وحدات تحكم المجال Dc النقوي، أيضا يعرف باسم Dc التقليدية (المؤلفان)، تتميز بالتعبير عن CD11c ويمكن أن تكون متباينة DCs (البلدان الجزرية النامية) غير ناضجة في المختبر من خلايا السلف نخاع العظام أو الدم المحيطي وحيدات باستخدام عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)، وايل-4 في الأنواع موريني أو البشرية، على التوالي4.
تفعيل ‘خطر’ إشارات، مثل أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بمب) أو أنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (الرطوبة)، سوف تدفع البلدان الجزرية النامية النضج تجاه DCs مكسبه ناضجة DCs (مدكس) عبر ملزم مستقبلات الاعتراف بنمط مختلف سطح DC5. DCs مكسبه كذلك رئيس الوزراء تكاثر الخلايا T ساذجة والتمايز من خلال أوبريجوليشن مهسيي2، يغاندس كوستيمولاتوري (CD80 و CD86 و CD40)6، السيتوكينات، وسائر الوسطاء للذوبان7. سلسلة من الوسطاء المحترفين التهابات الإنتاج من “وحدات تحكم المجال Dc مكسبه” ضروري للتمايز سيتوكين بوساطة الخلايا T. على سبيل المثال، IFN-γ وايل-12 ضرورية ل التمايز Th18 و IL-1، إيل-6، وايل-23 حاسمة بالنسبة للسذاجة خلية T الاستقطاب نحو خلايا Th179. رغم DCs ناضجة الرد على المستضدات الأجنبية، غير المنضبط DC التنشيط بواسطة المستضدات الذاتية قد تسبب التذرية التسامح وتعزيز التنمية لأمراض المناعة الذاتية عن طريق توليد خلايا أوتوريكتيفي تي التنشيط الذي يؤدي إلى تدمير الأنسجة10 .
وقدمت التقارير الأخيرة دليل واضح على اللدونة DC، يتجلى في قدرتها على التفاعل مع إشارات مختلفة داخل بهم المكروية الأنسجة والتفريق إلى مجموعات فرعية متميزة المستجيب/القامع DC. الوسطاء للالتهابات، مثل TGF-β12، إيل-1011و 1 هو13 تبين أن تلعب دوراً مهما في قمع المناعة بحمل توليروجينيك DCs (تولدكس). هذه تولدكس الحصول على المهام التنظيمية وقمع انتشار الخلايا T14. وعلاوة على ذلك، انعدام التحفيز المشارك بوحدات تحكم المجال Dc وإنتاج الوسطاء للالتهابات من تولدكس سواء المساهمة في تنظيم دورات تعريفية للخلايا التائية التنظيمية (تريجس) وأيضا فعالة تحول دون Th1 و Th17 التمايز وتوسيع15. في الماضي عقدين، إمكانات علاجية تولدكس أبلغت العديد من المحققين. في هذه الدراسات، ولدت تولدكس ليس فقط تحسن الأعراض المرضية في مختلف النماذج السريرية لأمراض المناعة الذاتية16 إدارة السابقين فيفو ، لكنه أدى أيضا إلى تنمية التسامح المناعي في المرضى الذين17 ،18. من المثير للاهتمام، اليوم، العلاج تولدكس نظرت كنهج بديل أو مرافقة لأمراض المناعة الذاتية في العديد من التجارب السريرية، بما في ذلك نوع 1 مرض البول السكري19،20التهاب المفاصل، 21، التصلب المتعدد (MS)22،،من2324، و مرض كرون25.
وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي استخدمت لوضع تولدكس وأفادت مختبرات عدة أساليب لتوليد وتوصيف المظهرية من تولدكس. يمكن استخدام هذه الأساليب لتكاثر توليد تولدكس في المختبر من فروعه المكونة للدم والحفاظ على ستابلي لهم في توليروجينيك دولة في فيفو26،،من2728،29. البلدان الجزرية النامية يمكن تحويلها إلى تولدكس بالتعرض لمختلف العوامل الدوائية immunomodulatory أو السيتوكينات المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، فيتامين D3 عامل دوائية معروفة المعروفة لزيادة إنتاج إيل-10 وقمع إفراز إيل-12 من وحدات تحكم المجال Dc ومما يعزز هذه الدالة كآبته30. وعلاوة على ذلك، عندما يتعرض DCs للمنبهات تحريضية قوية، مثل ليبوبوليساكتشاريديس (LPS)، عدة وكلاء الدوائية مثل الديكساميتازون31و32من ربمسن القشرية33 قد ثبت للحث النمط الظاهري تولدك بتخفيض DC التعبير السطحي CD40، CD80، CD86، ومهسيي34. إيل-10 و TGF-β، أظهرت السيتوكينات المضادة للالتهابات التي درست معظم للحث على التسامح العاصمة35 والتعرض ملازم لكل من هذه السيتوكينات للحث النمط الظاهري توليروجينيك في وحدات تحكم المجال Dc36.
منذ توليروجينيك DC تتحدد بالخصائص الوظيفية بدلاً من قبل علامات المظهرية، هناك كبيرة تحتاج إلى تطوير طريقة متسقة لتوصيف تولدكس الخلوية والوظيفية. وعلاوة على ذلك، يجب إنشاء بروتوكول دقيق ومتسق للتقييم متسقة ووصف النمط الظاهري توليروجينيك العاصمة إذا ما أردنا مقارنة فعالية وتكاثر عوامل جديدة قادرة على حمل النمط الظاهري تولدك في مختبر. هنا نقدم بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة طرق لعزل البلدان الجزرية النامية من فروعه المكونة للدم في الفئران وبعد ذلك تحليل فعالية عوامل جديدة قيد التقييم لقدرتها على تحويل البلدان الجزرية النامية في تولدكس، توفير قوي توصيف وظيفي والمظهرية تولدكس في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويشمل هذا الوصف أسلوب وضع وصف تولدكس يغاندس السطحية وسيتوكين الشخصية، ووظائف كآبته في المختبر. كما نقدم مثالاً على طريقة لاستكشاف إمكانية تطبيق العلاج من هذه تولدكس في نموذج ما قبل سريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد، النخاع الذاتية التجريبية (ع). هذا البروتوكول المتبعة سوف يساعد المحققين لتقييم قدرة عوامل جديدة النهوض بتحريض تولدكس وسيتم تيسير الجهود الرامية إلى توسيع نطاق التنمية العلاجية تولدك.
وتصف هذه الورقة على بروتوكول فعالة التي يمكن استخدامها لتكاثر لتوليد البلدان الجزرية النامية وبعد ذلك التفريق بينهم في تولدكس، ونقترح أن هذا يمكن تطبيقها على تقييم قدرة وكلاء الهدف جزيئية جديدة للحث تولدك النمط الظاهري. وكما هو مبين في هذا التقرير، تابعنا تسلسل التي نحن أولاً تحليل التع?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر “ريتا المستحضرات الصيدلانية” لتوفير كدو-مديرة. كما نعترف بالدعم لجين ولي الرئاسة سيدمان في “طب السرطان الابتكار” (جون ليتيريو). هذا العمل كان تدعمها وزارة الدفاع [W81XWH-12-1-0452]؛ مبادرة بحوث السرطان الكبار فاولر إنجي المراهقين والشباب في مركز السرطان الشامل في القضية؛ وجائزة الباحث خريج كالاهان وي جو الجمعيتان من مؤسسة كالاهان إف جي.
CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |