כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.
מערכת החיסון פועלת על ידי שמירה על איזון הדוק בין תיאום תגובות נגד אנטיגנים זרים, שמירה על מצב שאינו מגיב נגד אנטיגנים העצמי, כמו גם אנטיגנים נגזר מאורגניזמים commensal. שיבוש הומאוסטזיס החיסון הזה יכול להוביל לדלקת כרונית להתפתחות של מחלת חיסון עצמי. תאים דנדריטים (Dc) הם תאים אנטיגן מקצועיים של מערכת החיסון המולדת הכרוכה בהפעלתו תמים T תאים ליזום תגובות מערכת החיסון כנגד אנטיגנים זרים. עם זאת, ניתן להבחין DCs גם לתוך TolDCs שפועלים כדי לשמר ולקדם את תא T סובלנות וכדי לדכא את התאים אפקטור תורמים להתפתחות של תנאים או דלקת אוטואימונית או כרונית. ההתקדמות האחרונה בהבנה שלנו של TolDCs מרמז כי DC סובלנות יכולה להיות מושגת על ידי להתכוונן מצבם בידול. תופעה זו הובילה לצמיחה אדירה בפיתוח טיפולים TolDC רבים כשל חיסוני נגרמת בשל לפרוץ סובלנות המערכת החיסונית. להצלחה בלימודים במודלים מאתר פרה מחלת חיסון עצמי יש נוספת לאמת את התועלת immunotherapeutic של TolDCs בטיפול של הפרעות אוטואימוניות. היום, TolDCs הפכו כלי immunotherapeutic מבטיח במרפאה עבור החזרתו של רגישות המערכת החיסונית בהפרעות חיסוניים שונים על ידי מיקוד תגובות אוטואימוניות פתוגניים תוך השארת חיסון הגנתי ללא פגע. למרות מגוון של אסטרטגיות הוצע על ידי מעבדות מרובים כדי לגרום TolDCs, יש אין עקביות באפיון של פנוטיפ הסלולר ופונקציונליים של תאים אלה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד להתפתחות של מח עצם-derived DCs במספרים גדולים, שיטה ייחודית המשמשת כדי להבדיל אותם לתוך TolDCs עם triterpenoid סינתטי 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic חומצה-difluoro-propyl-אמיד (CDDO-DFPA), של טכניקות השתמשו כדי לאשר פנוטיפ שלהם, כולל ניתוחים של חיוניות חתימות מולקולרית של TolDCs. לבסוף, אנו מראים שיטה להערכת הפונקציה TolDC על-ידי בדיקת שלהם לדיכוי המערכת החיסונית בתגובה במבחנה וב -vivo במודל של פרה של טרשת נפוצה.
תאים דנדריטים (Dc) הם חלק אינטגרלי של מערכת החיסון המולדת, היו ראשית גילה, מאופיין על ידי ראלף שטיינמן, כהן Zanvil בשנת 1973 כמו הצגת אנטיגן מקצועיים ראשי תאים1. DCs הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהפעלת מערכת החיסון על ידי הצגת אנטיגנים מעובד על תאי T ותאי B באמצעות קומפלקסים histocompatibility הגדולות (MHC) באיברים הלימפה משני כדי לקשר את מולדת ומערכות החיסון מסתגלת2. המערכת החיסונית יונקים, יש לפחות שתי קטגוריות של בקרי קבוצת מחשבים אשר תוארו מיאלואידית DCs ו- plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (שיתפקדו)3. תאים מיאלואידים DCs, ידוע גם בשם DCs קונבנציונאלי (cDCs), מאופיינים על ידי הביטוי של CD11c, ניתן להבחין כמו בקרי קבוצת מחשבים (iDCs) לא בוגר חוץ גופית בתוך מח העצם ובתאים או ומונוציטים דם היקפיים באמצעות פקטור גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF) ו- IL-4 במאתר או מין אנושי, בהתאמה4.
הפעלת ‘סכנה’ אותות, כגון פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרית (PAMP) או נזק-הקשורים דפוסי מולקולרית (רטיבות), יניעו ההבשלה iDCs לכיוון immunogenic DCs בתור בוגר בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) דרך מחייבות קולטנים שונים של זיהוי תבנית DC משטח5. Immunogenic Dc נוסף פריים התפשטות תא T נאיבי ובידול דרך קולטנים upregulation של MHCII2, ליגנדים costimulatory (CD80, CD86 ו- CD40)6, ציטוקינים מגשרים מסיסים אחרים7. מפל של המתווך הפרו דלקתיים הפקה של Dc Immunogenic חיוני עבור תא T בתיווך ציטוקין בידול. לדוגמה, IFN-γ ו- IL-12 נחוצים Th1 בידול8 ו- IL-1, IL-6, ו- IL-23 הם קריטיים עבור תמים קיטוב תא T לכיוון תאי Th179. למרות DCs בוגרת מגיבים אנטיגנים זרים, הפעלת DC לא מבוקרת על ידי העצמי-אנטיגנים עלול לגרום סובלנות אבלציה ולטפח התפתחות מחלות אוטואימוניות על ידי יצירת autoreactive T תאים אשר הפעלת מוביל הרס רקמות10 .
דיווחים אחרונים סיפקו ראיות ברורות של DC פלסטיות, ומעוררות את יכולתם לתקשר ברמזים שונים בתוך microenvironment רקמות שלהם וכדי להבדיל לערכות אפקטור ברורים/DC מדכא. המתווכים אנטי-דלקתי, כגון IL-1011, TGF-β12והו-113 הוכחו לשחק תפקיד חשוב בדיכוי המערכת החיסונית על ידי גרימת tolerogenic בקרי קבוצת מחשבים (TolDCs). TolDCs אלה לרכוש פונקציות רגולטוריות, לדכא את תא T התפשטות14. יתר על כן, העדר גירוי משותף על-ידי בקרי ואת הייצור של מגשרים אנטי דלקתיות של TolDCs לתרום אינדוקציה של הרגולציה ותאי T (Tregs) והן גם ביעילות לעכב Th1 והן Th17 בידול והתרחבות15. אחרי שני עשורים, הפוטנציאל הטיפולי של TolDCs דווח על ידי מספר חוקרים. במחקרים אלה, הממשל של לשעבר-vivo המופקים סימפטומים פתולוגיים TolDCs לא רק יושבחו במודלים פרה שונה של מחלות אוטואימוניות16 אבל גם הוביל את הפיתוח של רגישות המערכת החיסונית בחולי17 ,18. מעניין, היום הטיפול TolDCs נחשב כמו גישה חלופית או משלים עבור מחלות אוטואימוניות בניסויים קליניים מספר, כולל מסוג 1 סוכרת19, דלקת מפרקים שגרונית20, 21, טרשת נפוצה (MS)22,23,24, ו- מחלת קרוהן25.
ישנם מגוון של פרוטוקולים נועדה לפתח TolDCs, מספר מעבדות דיווחו על שיטות הדור, אפיון פנוטיפי של TolDCs. שיטות אלה ניתן לייצר reproducibly TolDCs במבחנה אבות hematopoietic, לשמור אותם על stably tolerogenic המדינה ויוו26,27,28,29. ניתן להמיר את iDCs TolDCs על ידי חשיפה שונים immunomodulatory סוכנים תרופתי או ציטוקינים אנטי דלקתיות. לדוגמה, ויטמין D3 הוא סוכן תרופתי ידוע ידוע אל להגדיל ייצור IL-10, לדכא את הפרשת IL-12 מ- Dc, ובכך להגביר את הפונקציה לדיכוי המערכת החיסונית שלהם30. יתר על כן, כאשר DCs חשופים לגירויים דלקתי חזק, כגון lipopolysaccharides (LPS), מספר סוכנים תרופתי כגון דקסמתזון31, rapamycin32קורטיקוסטרואידים33 הוכחו כדי לעודד פנוטיפ TolDC על-ידי הפחתת ביטוי משטח DC CD40, CD80, CD86 ו- MHCII34. IL-10 ו- TGF-β הן רוב: לימודי ציטוקינים אנטי דלקתיות לזירוז DC סובלנות35 , חשיפה והמצוות הן של ציטוקינים אלה הוכחו לגרום פנוטיפ tolerogenic ב Dc36.
מאז tolerogenic ש-DC מוגדרת על-ידי מאפיינים פונקציונליים ולא על ידי סמנים פנוטיפי, שם הוא נהדר צריך לפתח שיטה עקבית של אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs. יתר על כן, נוהל קפדני ועקבית יש ליצור את אפיון פנוטיפ tolerogenic DC והערכת עקבי אם אנחנו רוצים ביעילות, reproducibly להשוות את היכולת של סוכנים חדשים כדי לעודד את פנוטיפ TolDC ב מעבדה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם שיטות שלב אחר שלב כדי לבודד את iDCs של אבות hematopoietic של עכברים וכדי לאחר מכן לנתח את היעילות של סוכנים חדשים תחת הערכת היכולת שלהם להמיר iDCs TolDCs, מתן של חזקים אפיון פנוטיפי פונקציונלי של TolDCs גם במבחנה וגם בתוך vivo. תיאור זה כולל שיטה משוכללת כדי לאפיין את TolDCs על ידי שלהם ליגנדים משטח, ציטוקינים בפרופיל פונקציות לדיכוי המערכת החיסונית במבחנה. אנו מספקים גם דוגמה של שיטה כדי לחקור את היישום טיפולית פוטנציאל של אלה TolDCs במודל של ניסויים פרה-קליניים של MS, ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). פרוטוקול הוקמה זה יסייע החוקרים להעריך את היכולת של סוכנים חדשים כדי לקדם את אינדוקציה של TolDCs, יקל על המאמץ להרחיב את היקף הפיתוח טיפוליות TolDC.
מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל זה עשוי לשמש reproducibly ליצירת iDCs, לאחר מכן להבדיל אותם לתוך TolDCs, אנו מציעים כי זה ניתן להחיל כדי להעריך את היכולת של סוכנים היעד מולקולריים חדשים כדי לעודד את TolDC פנוטיפ. כפי שמתואר בדו ח זה, עקבנו רצף שבו קודם ניתחנו ביטוי TolDC של ליגנדים פני השטח על ידי cytometry זרימה, ואח?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ריאטה תרופות על מתן CDDO-DFPA. אנו גם להכיר את התמיכה של ג’יין, לי כיסא זיידמן בחדשנות סרטן בילדים (ג’ון Letterio). עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה [W81XWH-12-1-0452]; יוזמת המחקר אנג’י פאולר המתבגר ויאנג של סרטן מבוגרים, בכל מקרה מקיף במרכז לחקר הסרטן; ופרס קלהאן בוגר מלומד עבור מצב Hsi-ג’ו ווי מקרן F.J. קלהאן.
CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |