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Medicine

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Abstract

Il sistema immunitario opera mantenendo un equilibrio stretto tra coordinamento risposte contro antigeni estranei e mantenere uno stato non rispondono contro autoantigeni come pure gli antigeni derivati da organismi commensali. La rottura di questa omeostasi immunitaria può portare a un’infiammazione cronica e lo sviluppo dell’autoimmunità. Le cellule dendritiche (DCs) sono le cellule presentanti l’antigene professionale del sistema immunitario innato coinvolto nell’attivazione di cellule T naïve per avviare le risposte immunitarie contro antigeni estranei. Tuttavia, DCs possono essere differenziate anche in TolDCs che agiscono per mantenere e promuovere la tolleranza delle cellule T e di sopprimere le cellule effettrici che contribuiscono allo sviluppo di entrambi condizioni di infiammazione cronica o autoimmune. Il recente progresso nella nostra comprensione di TolDCs suggerisce che tolleranza DC può essere realizzato modulando le loro condizioni di differenziazione. Questo fenomeno ha portato ad una crescita enorme nello sviluppo di terapie TolDC per numerosi disturbi del sistema immunitario causati dovuto rompere in tolleranza immunitaria. Studio di successo in modelli murini di autoimmunità preclinici ulteriormente hanno convalidato l’utilità immunoterapia di TolDCs nel trattamento dei disordini autoimmuni. Oggi, TolDCs sono diventati uno strumento promettente immunoterapia nella clinica per reintegrare la tolleranza immunitaria in vari disordini immuni mirando ai patogene risposte autoimmuni mantenendo intatti l’immunità protettiva. Anche se una matrice delle strategie è stato proposto da vari laboratori per indurre TolDCs, c’è alcuna coerenza nel caratterizzare il fenotipo cellulare e funzionale di queste cellule. Questo protocollo fornisce una guida passo passo per lo sviluppo di derivate da midollo osseo DCs in gran numero, un unico metodo utilizzato per differenziarli in TolDCs con un triterpenoide sintetico 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acido-difluoro-propil-ammide (CDDO-DFPA) e le tecniche utilizzate per confermare il loro fenotipo, incluse le analisi di firme molecolari essenziali di TolDCs. Infine, vi mostriamo un metodo per valutare la funzione TolDC testando loro immunosopressiva risposta in vitro e in vivo in un modello preclinico di sclerosi multipla.

Introduction

Cellule dendritiche (DCs) sono parte integrante del sistema immunitario innato e sono stati scoperti e caratterizzate da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 come antigene professionale primario che presenta cellule1. DCs hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nell’attivazione del sistema immunitario con la presentazione di antigeni processati a cellule T e cellule di B via complessi di istocompatibilità (MHC) negli organi linfoidi secondari per collegare il sistema immunitario innato e adattivo2. Nel sistema immunitario mammifero, ci sono almeno due categorie di DCs che sono stati descritti come DCs mieloidi e plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloidi, noto anche come DCs convenzionali (cDCs), sono caratterizzati dall’espressione di CD11c e possono essere differenziati come immaturi DCs (IDC) in vitro da cellule progenitrici del midollo osseo o monociti del sangue periferico mediante del granulocyte-macrofago-colony-stimulating factor (GM-CSF) e IL-4 in specie murina o umano, rispettivamente4.

Segnali di attivazione «pericolo», come pattern molecolari associati (PAMP) o pattern molecolari associati danni (umido), guiderà iDCs maturazione verso immunogeno DCs come DC mature (MDC) via vincolanti per diversi recettori di riconoscimento di pattern la superficie di DC5. Proliferazione delle cellule T naive e differenziazione con il upregulation di MHCII2, ligandi costimolazione (CD80, CD86 e CD40)6, citochine e altri mediatori solubili7prime immunogeno DCs ulteriormente. Una cascata di produzione mediatore pro-infiammatorio da DCs immunogeno è essenziale per il differenziamento di citochina-mediata delle cellule di T. Ad esempio, sia di IFN-γ e di IL-12 sono necessari per Th1 differenziazione8 e il-1, IL-6 e IL-23 sono critici per ingenuo polarizzazione delle cellule T nei confronti di cellule Th179. Anche se DC mature reagire agli antigeni stranieri, attivazione incontrollata di DC di auto-antigeni può causare ablazione di tolleranza e favorire lo sviluppo delle malattie autoimmuni tramite la generazione di cellule T autoreattive cui attivazione porta alla distruzione del tessuto10 .

I rapporti recenti hanno fornito prove evidenti della plasticità DC, esemplificato dalla loro capacità di interagire con diversi spunti nel loro microambiente di tessuto e di differenziarsi in sottogruppi distinti dell’effettore/soppressore DC. I mediatori anti-infiammatori, quali IL-10,11, TGF-β12e13 di HO-1 hanno dimostrati di giocare un ruolo importante nella soppressione immune inducendo tollerogeniche DCs (TolDCs). Questi TolDCs acquisire funzioni di regolamentazione e sopprimere la proliferazione di cellule T14. Inoltre, la mancanza di co-stimolazione di DCs e la produzione di mediatori anti-infiammatori da TolDCs sia contribuire all’induzione di cellule T regolatorie (Treg) e anche efficacemente inibire la differenziazione e l’espansione sia Th1 e Th1715. In oltre due decenni, il potenziale terapeutico di TolDCs è stato segnalato da parecchi ricercatori. In questi studi, la somministrazione di ex vivo generata TolDCs non solo ha migliorato i sintomi patologici in diversi modelli preclinici di malattie autoimmuni16 ma inoltre ha condotto allo sviluppo della tolleranza immunitaria nei pazienti17 ,18. È interessante notare che, oggi la terapia TolDCs è stata considerata come un approccio alternativo o adjunctive per le malattie autoimmuni in diversi studi clinici, tra cui tipo 1 diabete mellito19, artrite reumatoide20, 21, sclerosi a placche (MS)22,23,24e di malattia di Crohn25.

Ci sono una varietà di protocolli che sono stati impiegati per sviluppare TolDCs e diversi laboratori sono segnalati i metodi per la generazione e caratterizzazione fenotipica di TolDCs. Questi metodi possono essere utilizzati per generare riproducibile TolDCs in vitro da progenitori ematopoietici e per mantenerli stabilmente in un tollerogeniche stato vivo26,27,28,29. Il iDCs può essere convertito in TolDCs tramite l’esposizione ai vari agenti farmacologici immunomodulatori o citochine antinfiammatorie. Ad esempio, la vitamina D3 è un noto agente farmacologico noto per aumentare la produzione di IL-10 e sopprimere la secrezione di IL-12 da DCs e quindi Spinta loro funzione immunosopressiva30. Inoltre, quando DCs sono esposte a stimoli infiammatori potenti, quali i lipopolisaccaridi (LPS), diversi agenti farmacologici quali desametasone31, rapamicina32e corticosteroidi33 sono stati indicati per indurre la Fenotipo TolDC riducendo l’espressione di superficie di CD40, CD80, CD86 e MHCII34DC. IL-10 e TGF-β sono le citochine antinfiammatorie più studiato per indurre tolleranza di DC35 e l’esposizione concomitante ad entrambe queste citochine sono state indicate per indurre un fenotipo tollerogeniche in DCs36.

Dal tollerogeniche DC è definito dalle caratteristiche funzionali piuttosto che di marcatori fenotipici, c’è un grande bisogno di sviluppare un metodo coerente per caratterizzazione cellulare e funzionale di TolDCs. Inoltre, occorre stabilire un protocollo rigoroso e coerenza per la costante valutazione e caratterizzazione del fenotipo di cellule DC tollerogeniche se siamo in modo efficace e riproducibile confrontare la capacità di nuovi agenti di indurre il fenotipo di TolDC nella laboratorio. Qui forniamo un protocollo dettagliato con metodi dettagliati per isolare iDCs da progenitori ematopoietici dei topi e successivamente analizzare l’efficacia di nuovi agenti nell’ambito della valutazione per la loro capacità di convertire iDCs in TolDCs, che fornisce un robusto caratterizzazione fenotipica e funzionale di TolDCs sia in vitro che in vivo. Questa descrizione include un metodo elaborato per caratterizzare il TolDCs da loro leganti di superficie, il profilo di citochina e funzioni immunosoppressive in vitro. Forniamo anche un esempio di un metodo per esplorare il potenziale applicazione terapeutica di questi TolDCs in un modello preclinico di MS, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo stabilito aiuterà i ricercatori a valutare la capacità di nuovi agenti per promuovere l’induzione di TolDCs e faciliterà lo sforzo per ampliare l’ambito di sviluppo terapeutico TolDC.

Protocol

Tutti gli studi sono stati effettuati nel rispetto delle procedure approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale della Case Western Reserve University School of Medicine. 1. preparare le cellule dendritiche derivate da midollo osseo (BMDCs) Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l’esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate. Eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di et?…

Representative Results

La differenziazione e la selezione di BMDCs: Cellule progenitrici del midollo osseo sono state coltivate in terreno RPMI completo in presenza di GM-CSF e IL-4 di differenziarsi in IDC per 7 giorni (Figura 1A). Il giorno 1, cellule erano di piccole dimensioni ed ha mostrato la morfologia sferica. Lavaggio con PBS prima la sostituzione del mezzo fresco il giorno 3 aiutato cellule ai c…

Discussion

Questo documento descrive un efficiente protocollo che può essere utilizzato per riproducibile per generare iDCs e successivamente li differenziano in TolDCs, e proponiamo che questo può essere applicato per valutare la capacità di nuovi agenti a bersaglio molecolare per indurre il TolDC fenotipo. Come descritto in questo rapporto, abbiamo seguito una sequenza in cui abbiamo analizzato prima TolDC espressione di leganti di superficie tramite flusso cytometry, seguito da una valutazione del profilo di citochina DC come…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Reata Pharmaceuticals per la fornitura di CDDO-DFPA. Riconosciamo anche il supporto del Jane e Lee Seidman Chair in innovazione di cancro pediatrico (John Letterio). Questo lavoro è stato sostenuto dal dipartimento della difesa [W81XWH-12-1-0452]; l’iniziativa di ricerca cancro adulti Angie Fowler adolescente e giovane al caso Comprehensive Cancer Center; e il premio di studioso di Callahan laureato per Hsi-Ju Wei da F.J. Callahan Foundation.

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
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References

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Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
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