Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa
Summary
El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.
Abstract
Bacterias beneficiosas planta juegan un papel importante en promover el crecimiento y prevención de enfermedades en plantas. La aplicación de planta rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR) como agentes biofertilizantes o control biológico se ha convertido en una alternativa eficaz al uso de fertilizantes convencionales y puede aumentar la productividad de los cultivos a bajo costo. Interacciones planta-microorganismo dependen de señales secretadas por la planta anfitrión y una reacción de aquí en adelante por sus bacterias asociadas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de bacterias beneficiosas como responden a sus asociados de origen vegetal las señales no se entienden completamente. Valoración de la respuesta de transcriptómicos de bacterias en los exudados de la raíz es un poderoso enfoque para determinar la expresión génica bacteriana y Reglamento condiciones rizosféricos. Tal conocimiento es necesario entender los mecanismos subyacentes involucrados en interacciones planta-microorganismo. Este papel describe un protocolo detallado para estudiar la respuesta de transcriptómicos de B. mycoides EC18, una cepa aislada de la endosphere de la patata, a exudados de raíces de papa. Con la ayuda de la reciente tecnología de secuenciación de alto rendimiento, este protocolo puede realizarse en varias semanas y produce enormes conjuntos de datos. En primer lugar, recogemos los exudados de la raíz en condiciones estériles, después de lo cual se agregan a las culturas B. mycoides . El ARN de estas culturas se aísla método de fenol/cloroformo, combinada con un kit comercial y sujeto a control de calidad por un instrumento de electroforesis automatizada. Después de la secuenciación, análisis de datos se realizaron con la tubería T-REx en la web y se identifica un grupo de genes diferencialmente expresados. Este método es una herramienta útil para facilitar nuevos descubrimientos sobre los genes bacterianos implicados en interacciones planta-microorganismo.
Introduction
Las plantas pueden exudado hasta un 20% del carbono fijado durante la fotosíntesis a través de las raíces en la rizosfera1, es decir, la zona estrecha de tierra cerca de las raíces. Debido a la mayor disponibilidad de nutrientes, la rizosfera es un habitat conveniente para diversos microorganismos, incluyendo bacterias promotoras de crecimiento vegetal. Los exudados de la raíz contienen una gama de compuestos inorgánicos como agua, iones, ácidos inorgánicos y oxígeno. Sin embargo, la mayoría de los exudados de la raíz está formada por materiales orgánicos, que pueden dividirse en compuestos de bajo peso molecular y alto peso molecular compuestos. Los compuestos de bajo peso molecular son aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, compuestos fenólicos, ácidos grasos y una gran variedad de metabolitos secundarios. Los compuestos de alto peso molecular consisten en mucílagos y proteínas2,3. Microorganismos de la rizosfera pueden utilizar algunos de estos compuestos como fuente de energía para el crecimiento y desarrollo. Los exudados de la raíz juegan un papel importante en la conformación de la comunidad de rizobacterias puesto que los compuestos producidos por la planta en los exudados pueden influir en el comportamiento de las bacterias de rizósfera asociados que afectan a la expresión de genes específicos.
Comprensión de la respuesta bacteriana a los exudados de la raíz es un paso clave en el desciframiento de los mecanismos de interacción planta-microorganismo. Como la respuesta bacteriana a interacciones planta-microorganismo es el producto de la expresión génica diferencial, puede ser estudiada mediante el análisis de transcriptoma. Usando este método, estudios previos identificaron varios genes importantes implicados en interacciones planta-microorganismo. En Pseudomonas aeruginosa, genes implicados en metabolismo, quimiotaxis y tipo de secreción de II han demostrado responder a remolacha raíz exudados4. Fan et al. 5 estudia el perfil transcriptómico de B. amyloliquefaciens FZB42 en respuesta a los exudados de raíces de maíz. Sus resultados muestran que, de los genes fuertemente inducidos por los exudados de la raíz, varios grupos están involucrados en rutas metabólicas relacionadas con la utilización de nutrientes, quimiotaxis, motilidad y síntesis no ribosomal de péptidos antimicrobianos y Policétidos.
La exactitud de estos estudios se basa en la colección de exudados de la raíz. Aunque varios métodos han descrito la colección de exudados de la raíz para diversos propósitos, se requieren instrumentos sofisticados o no se hacen en condiciones bien controladas6,7,8. Además, inhibir la rizosfera microorganismos pueden influir en composición del exudado de raíz afectando la permeabilidad de la membrana de la célula vegetal y daño de los tejidos de la raíz, particularmente en el caso de consorcios de microorganismos9. Al investigar la respuesta microbiana a los exudados de la raíz, es importante utilizar condiciones bien definidas para evitar la alteración de los compuestos por otros microorganismos10. Además, RNA de alta calidad se requiere para RNA-seq basados en estudios de transcriptoma. Sin embargo, cuando se trata con cepas bacterianas de modelo no, los protocolos estándar o kits comerciales suelen tienen un bajo rendimiento debido a factores desconocidos o propiedades de crecimiento especial.
El protocolo descrito aquí se verificó utilizando B. mycoides, que es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas del filo Firmicute. Es ubicuo en la rizosfera de diferentes especies de plantas. Varias propiedades promotoras de crecimiento de planta han sido reportadas para esta especie, incluida la inducción de resistencia sistemática (ISR) en remolacha azucarera11, inhibición del damping-off patógeno Pythium pepino12, así como nitrógeno fijación en la rizósfera de girasol13. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la interacción con una planta de host no están bien estudiados.
El objetivo de los experimentos aquí presentados es estudiar la respuesta de transcriptómico del endosphere aislado B. mycoides a exudados de raíces de papa. En Resumen, el protocolo consta de los siguientes pasos: en primer lugar, recoger exudados de raíces de papa bajo condiciones estériles. Luego, extraer RNA de alta calidad de las células bacterianas tratadas con exudados de la raíz. El último paso es el análisis de datos uso de tubería de T-REx en la web14. Este protocolo se utiliza para identificar los genes B. mycoides que muestran un cambio en niveles de expresión al entrar en contacto con exudados de la raíz y así podrían desempeñar un papel importante en las interacciones planta-microorganismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Han planteado la hipótesis de interacciones planta-microorganismo para ser determinado por un equilibrio finamente sintonizado entre bacterias y plantas. Estas interacciones son muy complejas y difíciles de estudiar en un sistema natural, que comprende diversas especies microbianas, potencialmente actuar como consorcios. Este papel describe un protocolo simplificado para estudiar la respuesta bacteriana a los exudados de la raíz en condiciones bien controladas. El perfil del transcriptoma de rizobacterias, sobre expos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jakob Viel por sus valiosos comentarios y sugerencias. También agradecemos a Anne de Jong por su ayuda en el análisis de la bioinformática. Yanglei Yi y Zhibo Li son apoyados por el Consejo de becas de China (CSC). Agradecemos a NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) por su apoyo financiero a OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
