Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata
Summary
O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.
Abstract
Bactérias benéficas associadas a planta é um papel importante na promoção do crescimento e prevenção de doenças em plantas. A aplicação (PGPR) rizobactérias promotoras de crescimento da planta como agentes de biofertilizantes ou biocontrole tornou-se uma alternativa eficaz para o uso de fertilizantes convencionais e pode aumentar a produtividade das culturas a baixo custo. Interações planta-micróbio dependem de sinais de planta-secretada de acolhimento e uma reação diante de suas bactérias associadas. No entanto, os mecanismos moleculares de bactérias benéficas como respondem a seus associados de origem vegetal os sinais não são totalmente compreendidos. Avaliar a resposta de transcriptomic de bactérias exsudados de raiz é uma poderosa abordagem para determinar a expressão de gene bacteriano e regulamento sob condições rizosférico. Tal conhecimento é necessário compreender os mecanismos subjacentes envolvidos em interações planta-micróbio. Este artigo descreve um protocolo detalhado para estudar a resposta de transcriptomic de b. mycoides EC18, uma cepa isolada do endosphere a batata, exsudados de raiz de batata. Com a ajuda da recente tecnologia de sequenciamento de alta produtividade, este protocolo pode ser executado em várias semanas e produzem enormes conjuntos de dados. Primeiro, nós coletamos os exsudados de raiz em condições estéreis, após o qual eles são adicionados à b. mycoides culturas. O RNA destas culturas é isolado, usando um método de fenol/clorofórmio, combinado com um kit comercial e submetido a um controlo de qualidade por um instrumento automatizado de electroforese. Após o sequenciamento, análise de dados é executada com o pipeline de T-REx baseado na web e um grupo de genes diferencialmente expressos é identificado. Este método é uma ferramenta útil para facilitar novas descobertas sobre os genes de bactérias envolvidas em interações planta-micróbio.
Introduction
As plantas podem exsudato até 20% do carbono fixado durante a fotossíntese através de raízes para a rizosfera1, ou seja, a zona estreita de solo perto das raízes. Devido à maior disponibilidade de nutrientes, a rizosfera é um habitat adequado para diversos microorganismos, incluindo bactérias promotoras de crescimento vegetal. Os exsudados de raiz contêm uma variedade de compostos inorgânicos como íons, ácidos inorgânicos, oxigênio e água. No entanto, a maioria dos exsudados da raiz é formada por materiais orgânicos, que podem ser divididos em compostos de baixo peso molecular e alto peso molecular de compostos. Os compostos de baixo peso molecular incluem aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares, compostos fenólicos, ácidos graxos e uma matriz de metabólitos secundários. Os compostos de alto peso molecular consistem de mucilagem e proteínas de2,3. Microrganismos da rizosfera podem usar alguns destes compostos como fonte de energia para o crescimento e desenvolvimento. Os exsudados de raiz desempenham um papel importante na formação da comunidade de rhizobacterial, desde que os compostos vegetais produzidos no exsudado podem influenciar o comportamento das bactérias associadas a rizosfera afetando a expressão de genes específicos.
Compreender a resposta bacteriana exsudados de raiz é um passo fundamental em decifrar os mecanismos de interação planta-micróbio. Como a resposta bacteriana às interações planta-micróbio é o produto da expressão gênica diferencial, podem ser estudado pela análise do transcriptoma. Usando esse método, estudos anteriores identificaram vários importantes genes envolvidos em interações planta-micróbio. Em Pseudomonas aeruginosa, genes envolvidos no metabolismo, quimiotaxia e tipo de secreção II foram mostrados para responder a de exsudados de raiz de beterraba4. Ventilador et al. 5 estudou o perfil transcriptomic de b. amyloliquefaciens FZB42 em resposta exsudados de raiz de milho. Seus resultados mostram que, dos genes fortemente induzidos por exsudados da raiz, vários grupos estão envolvidos em vias metabólicas relacionadas com a utilização de nutrientes, quimiotaxia, motilidade e não-ribossomais síntese de peptídeos antimicrobianos e policetídeos.
A precisão desses estudos baseia-se na coleção de exsudados radiculares. Embora vários métodos descreveu a coleção de exsudados radiculares para finalidades diferentes, eles exigem instrumentos sofisticados ou não são executados em condições bem controladas6,7,8. Além disso, microrganismos inibindo a rizosfera podem influenciar a composição do exsudado de raiz, afetando a permeabilidade de membrana da célula de planta e danificar os tecidos da raiz, particularmente no caso dos consórcios de microorganismos9. Ao investigar a resposta microbiana exsudados de raiz, é importante usar bem definidas condições para evitar a alteração dos compostos por outros microorganismos10. Além disso, o RNA de alta qualidade é necessária para RNA-seq baseados em estudos de transcriptoma. No entanto, quando se lida com as estirpes não-modelo-bacteriana, os protocolos padrão ou jogos comerciais geralmente têm uma baixa eficiência devido a fatores desconhecidos ou propriedades especiais de crescimento.
O protocolo descrito aqui foi verificado usando b. mycoides, que é uma bactéria Gram-positiva, formadoras de esporos do filo Firmicute. É onipresente na rizosfera de várias espécies de plantas. Várias propriedades promover crescimento de planta têm sido relatadas para esta espécie, incluindo indução de resistência sistemática (ISR) na beterraba açucareira11, inibição do umedecimento-fora agente patogénico Pythium para pepino12, bem como nitrogênio fixação na rizosfera girassol13. No entanto, os mecanismos moleculares de sua interação com a planta hospedeira não são bem estudados.
O objetivo dos experimentos apresentados aqui é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado b. mycoides exsudados de raiz de batata. Em suma, o protocolo consiste das seguintes etapas: primeiro, recolher exsudados de raiz de batata em condições estéreis. Em seguida, extrai o RNA de alta qualidade de células bacterianas tratadas com exsudados de raiz. A etapa final é a análise de dados usando o web-based T-REx gasoduto14. Este protocolo foi usado para identificar genes de b. mycoides que mostram uma mudança nos níveis de expressão em caso de contacto com exsudados de raiz e, portanto, podem desempenhar um papel importante nas interações planta-micróbio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interações planta-micróbio tem sido a hipótese de ser determinado por um equilíbrio afinado entre bactérias e plantas. Tais interações são altamente complexas e difíceis de estudar em um sistema natural, que é composto por diversas espécies microbianas, potencialmente atuando como consórcios. Este artigo descreve um protocolo simplificado para estudar a resposta bacteriana exsudados de raiz em condições bem controladas. O perfil do transcriptoma de rizobactérias, após a exposição exsudados de raiz, for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jakob Viel seus comentários úteis e sugestões. Agradecemos também a Anne de Jong por sua ajuda na análise bioinformática. Yanglei Yi e Zhibo Li são suportados pelo Conselho de bolsa da China (CSC). Agradecemos a NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pelo apoio financeiro ao OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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