Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen
Summary
Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.
Abstract
Pflanze-assoziierte Bakterien spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung von Wachstum und Verhütung von Krankheiten bei Pflanzen. Die Anwendung der Pflanze wachstumsfördernde standarddüngung (PGPR) als biodüngemittel oder Biocontrol Mittel geworden eine effektive Alternative zu der Verwendung von herkömmlichen Düngemitteln und Ernte-Produktivität bei geringen Kosten zu erhöhen. Pflanze-Mikroben-Interaktionen abhängig Host Pflanze abgesondert Signale und eine Reaktion hereon durch ihre assoziierten Bakterien. Die molekularen Mechanismen der wie nützlichen Bakterien reagieren jedoch auf die damit verbundenen pflanzliche, dass Signale nicht vollständig verstanden sind. Beurteilung der transkriptomischen auf der Bakterien Wurzelausscheidungen ist ein leistungsfähiger Ansatz um die bakterielle Genexpression und Verordnung unter rhizospheric Bedingungen zu bestimmen. Solches Wissen ist notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu verstehen. Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll um die transkriptomischen Antwort von B. Mycoides EC18, ein Stamm von der Kartoffel Endosphere, Kartoffel Wurzelausscheidungen isoliert zu studieren. Mit Hilfe der jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung-Technologie kann dieses Protokoll in mehreren Wochen und produzieren massive Datasets durchgeführt werden. Zunächst sammeln wir die Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen, nach denen sie B. Mycoides Kulturen hinzugefügt werden. Die RNA aus diesen Kulturen ist isoliert mit einem Phenol/Chloroform-Methode kombiniert mit einem kommerziellen Kit und durch automatisierte Elektrophorese Instrument einer Qualitätskontrolle unterzogen. Nach der Sequenzierung, Datenanalyse erfolgt mit der Web-basierten T-REx-Pipeline und eine Gruppe von differentiell exprimierten Genen identifiziert. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um neue Entdeckungen auf die bakterielle Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu ermöglichen.
Introduction
Pflanzen können Exsudat bis zu 20 % des Kohlenstoffs in der Rhizosphäre1, d. h., die schmale Zone des Bodens in der Nähe der Wurzeln während der Photosynthese durch Wurzeln fixiert. Durch die höhere nährstoffverfügbarkeit ist die Rhizosphäre einen geeigneten Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums Bakterien. Die Wurzelausscheidungen enthalten eine Reihe von anorganischen Verbindungen wie Ionen, anorganische Säuren, Sauerstoff und Wasser. Jedoch wird der Großteil der Wurzelausscheidungen von organischen Materialien, gebildet, in niedermolekulare Verbindungen und hochmolekularen Verbindungen unterteilt werden kann. Die niedermolekularen Verbindungen enthalten Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Phenolverbindungen, Fettsäuren und eine Reihe von sekundären Pflanzenstoffen. Die hochmolekularen Verbindungen bestehen aus Schleim und Proteine,2,3. Rhizosphäre Mikroorganismen können einige dieser Verbindungen als Energiequelle für Wachstum und Entwicklung. Die Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Wurzelbakterien Gemeinschaft, da die Pflanze produziert Verbindungen in die Exsudate durch Einwirkung auf die Expression bestimmter Gene das Verhalten der Rhizosphäre-assoziierte Bakterien beeinflussen können.
Verständnis der bakteriellen Antwort auf Wurzelausscheidungen ist ein wichtiger Schritt bei der Entschlüsselung wechselwirkungsmechanismen Pflanze-Mikroben. Da die bakterielle Reaktion auf Pflanze-Mikroben-Interaktionen das Produkt der differentiellen Genexpression, kann es durch die Transkriptom-Analyse untersucht werden. Mit dieser Methode, identifiziert frühere Studien mehrere wichtige Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. In Pseudomonas Aeruginosawurden Gene, die im Stoffwechsel, Chemotaxis und Typ II-Sekretion zur Beantwortung von Zuckerrüben Wurzel Exsudate4gezeigt. Ventilator Et Al. 5 studierte die transkriptomischen Profilierung der B. Amyloliquefaciens FZB42 als Reaktion auf Mais Wurzelausscheidungen. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die Gene, die stark durch die Wurzelausscheidungen induziert, Stoffwechselwege in Bezug auf Nährstoff Auslastung, Chemotaxis, Motilität und nicht-ribosomale Synthese von antimikrobiellen Peptiden und Polyketides mehrere Gruppen beteiligt sind.
Die Genauigkeit dieser Studien stützt sich auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen. Obwohl mehrere Methoden der Sammlung von Wurzelausscheidungen für verschiedene Zwecke beschrieben haben, entweder verlangen ausgeklügelte Instrumente oder sind nicht in kontrollierten Bedingungen6,7,8durchgeführt. Darüber hinaus können Hemmung der Rhizosphäre Mikroorganismen Wurzel Exsudat Zusammensetzung beeinflussen, indem Pflanze Zellmembran Durchlässigkeit beeinträchtigen und schädigen die Wurzel Gewebe, insbesondere im Falle von Konsortien von Mikroorganismen9. Bei der Untersuchung der mikrobiellen auf Wurzelausscheidungen ist es wichtig, genau definierte Bedingungen zu verwenden, um Veränderung der Verbindungen durch andere Mikroorganismen10zu vermeiden. Darüber hinaus ist qualitativ hochwertige RNA erforderlich für RNA-Seq Transkriptom-Studien. Jedoch haben beim Umgang mit nicht-Modell-bakterielle Belastungen, die standard-Protokolle oder kommerziellen Kits in der Regel eine geringe Effizienz durch unbekannte Faktoren oder spezielle Wachstumseigenschaften.
Das hier beschriebene Protokoll wurde mit B. Mycoides, das ist ein grampositives, Spore bildet Bakterium Firmicute Phylum überprüft. Es ist allgegenwärtig in der Rhizosphäre der verschiedenen Pflanzenarten. Für diese Spezies, einschließlich Induktion des systematischen Widerstandes (ISR) in Zuckerrüben11, Hemmung der Dämpfung-off-Erregers Pythium Gurke12sowie Stickstoff wurden mehrere Pflanze Förderung Wachstumseigenschaften gemeldet. Fixierung in der Sonnenblume Rhizosphäre13. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Interaktion mit einer Wirtspflanze nicht gut untersucht.
Das Ziel der hier vorgestellten Experimente ist es, die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert B. Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Kurzum, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: zunächst sammeln Kartoffeln Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie dann, qualitativ hochwertige RNA aus Bakterienzellen mit Wurzelausscheidungen behandelt. Der letzte Schritt ist die Analyse der Daten mithilfe der webbasierten T-REx Pipeline14. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B. Mycoides Gene zu identifizieren, die zeigen eine Verschiebung im Ausdruck Niveaus beim Kontakt mit Wurzelausscheidungen und damit möglicherweise eine wichtige Rolle in Pflanze-Mikroben-Interaktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pflanze-Mikroben-Interaktionen haben vermutet, um durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pflanzen bestimmt werden. Solche Interaktionen sind sehr komplex und schwierig zu studieren in ein natürliches System, umfasst verschiedene Mikrobenarten, potenziell als Konsortien. Dieses Whitepaper beschreibt ein vereinfachtes Protokoll, um die bakterielle Reaktion auf Wurzelausscheidungen unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Das Transkriptom-Profil des standarddüngung, bei Kontakt mit Wurzelau…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jakob Viel für seine hilfreichen Kommentare und Vorschläge. Wir danken auch Anne de Jong für seine Hilfe bei der Analyse der Bioinformatik. Yanglei Yi und Zhibo Li werden von der China Scholarship Council (CSC) unterstützt. Wir bedanken uns bei NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) für ihre finanzielle Unterstützung auf OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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