Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre
Summary
L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.
Abstract
Bactéries associées aux plantes jouent un rôle important dans la promotion de la croissance et la prévention des maladies chez les plantes. L’application des rhizobactéries promotrices de la croissance de plantes (PGPR) biofertilisants ou biocontrol agents est devenu une alternative efficace à l’usage des engrais classiques et peut augmenter la productivité des cultures à faible coût. Interactions plantes-microorganismes dépendent des signaux sécrétée à la plante hôte et une réaction sur le connaissement par leurs bactéries associées. Cependant, les mécanismes moléculaires des bactéries bénéfiques comment répondent à leurs associés végétale signaux ne sont pas totalement comprises. Évaluation de la réponse de transcriptomique des bactéries aux exsudats racinaires est une approche puissante pour déterminer l’expression de gène bactérien et règlement conditions rhizosphérique. Une telle connaissance est nécessaire pour comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Cet article décrit un protocole détaillé pour étudier la réponse de transcriptomique de b. mycoides CE18, une souche isolée chez l’endosphère de pommes de terre, d’exsudats racinaires de pommes de terre. Avec l’aide des récentes technologies de séquençage haut débit, ce protocole peut être effectué en plusieurs semaines et les ensembles de données massives de produits. Tout d’abord, nous collectons les exsudats des racines dans des conditions stériles, après quoi ils sont ajoutés à des cultures de b. mycoides . L’ARN de ces cultures est isolé en utilisant une méthode phénol/chloroforme combinée avec une trousse commerciale et soumises à un contrôle de qualité par un instrument automatisé de l’électrophorèse. Après le séquençage, analyse des données est effectuée avec le pipeline de T-REx sur le web et un groupe de gènes différentiellement exprimés est identifié. Cette méthode est un outil utile pour faciliter les nouvelles découvertes sur les gènes bactériens impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.
Introduction
Les plantes peuvent exsudat jusqu’à 20 % du carbone fixé lors de la photosynthèse par racines dans la rhizosphère1, c’est-à-dire, la zone étroite du sol près des racines. En raison de la plus grande disponibilité des éléments nutritifs, la rhizosphère est un habitat adéquat pour les divers micro-organismes, y compris les bactéries favorisant la croissance des plantes. Les exsudats des racines contiennent une variété de composés inorganiques comme les ions, acides inorganiques, d’oxygène et d’eau. Cependant, la majorité des exsudats racinaires est formée par les matières organiques, qui peuvent être divisés en des composés de faible poids moléculaire et masse moléculaire élevée de composés. Les composés de faible poids moléculaire sont des acides aminés, acides organiques, sucres, composés phénoliques, acides gras et un tableau de métabolites secondaires. Les composés de poids moléculaire élevé sont constitués de mucilage et protéines,2,3. Micro-organismes de la rhizosphère peuvent utiliser certains de ces composés comme source d’énergie pour la croissance et le développement. Les exsudats des racines jouent un rôle important dans le façonnement de la communauté des rhizobactéries puisque les composés de produits végétaux dans les exsudats peuvent influencer le comportement de bactéries associées à la rhizosphère par affecter l’expression de gènes spécifiques.
Comprendre la réaction bactérienne d’exsudats racinaires est une étape clé de décryptage des mécanismes d’interaction plante-microbe. Car la réponse bactérienne aux interactions plantes-microorganismes est le produit de l’expression différentielle des gènes, elle puisse être étudiée par l’analyse du transcriptome. En utilisant cette méthode, des études antérieures identifié plusieurs gènes importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Pseudomonas aeruginosa, gènes impliqués dans le métabolisme, le chimiotactisme et type de sécrétion II étaient divulgués pour répondre à la racine de betterave à sucre exsudats4. Fan et al. 5 a étudié la transcriptomique profilage de b. amyloliquefaciens FZB42 en réponse à des exsudats racinaires de maïs. Leurs résultats montrent que les gènes fortement induites par les exsudats racinaires, plusieurs groupes sont occupent de voies métaboliques liés à l’utilisation des éléments nutritifs, chimiotactisme, motilité et non ribosomale synthèse de peptides antimicrobiens et polyketides.
L’exactitude de ces études repose sur la collecte des exsudats racinaires. Plusieurs méthodes ont décrit la collection d’exsudats racinaires à différentes fins, ils exigent des instruments sophistiqués ou ne sont pas exécutées dans des conditions bien contrôlées6,7,8. Par ailleurs, les micro-organismes inhibant la rhizosphère peuvent influencer racine exsudat composition en affectant la perméabilité de la membrane de cellules végétales et endommager les tissus de la racine, notamment dans le cas de consortiums de micro-organismes9. Lors d’enquêtes sur la réponse microbienne d’exsudats racinaires, il est important d’utiliser des conditions bien définies afin d’éviter l’altération des composés par d’autres microorganismes10. En outre, RNA de haute qualité est obligatoire pour RNA-seq basé des études du transcriptome. Toutefois, lorsqu’il s’agit des souches non modèle-bactérienne, les protocoles standard ou les kits commerciaux ont généralement un faible rendement en raison de facteurs inconnus ou propriétés de croissance spécial.
Le protocole décrit ici a été vérifié à l’aide de b. mycoides, qui est une bactérie Gram positive sporulé du phylum des Firmicute. Il est omniprésent dans la rhizosphère des diverses espèces végétales. Plusieurs propriétés promotion de la croissance végétale ont été signalées pour cette espèce, y compris l’induction de résistance systématique (ISR) dans la betterave à sucre11, inhibition du pathogène fonte Pythium pour concombre12, ainsi que d’azote fixation dans la rhizosphère tournesol13. Cependant, les mécanismes moléculaires de ses interactions avec une plante hôte ne sont pas bien étudiés.
L’objectif des expériences présentées ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère b. mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. En bref, le protocole se compose des étapes suivantes : tout d’abord, recueillir des exsudats racinaires de pommes de terre dans des conditions stériles. Ensuite, extrayez qualité RNA de cellules bactériennes, traités avec les exsudats racinaires. La dernière étape est l’analyse des données avec les webmail T-REx pipeline14. Ce protocole a été utilisé pour identifier les gènes de b. mycoides qui montrent un changement dans les niveaux d’expression au contact des exsudats racinaires et donc pourraient jouer un rôle important dans les interactions plantes-microorganismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interactions plantes-microorganismes ont été hypothétiquement être déterminé par un équilibre finement réglé entre les bactéries et les plantes. Ces interactions sont très complexes et difficiles à étudier dans un système naturel, qui comprend diverses espèces microbiennes, potentiellement servir de consortiums. Cet article décrit un protocole simplifié pour étudier la réponse bactérienne d’exsudats racinaires dans des conditions bien contrôlées. Le profil de transcriptome de rhizobactéries, lors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jakob Viel pour ses précieux commentaires et suggestions. Nous remercions également Anne de Jong pour son aide dans l’analyse bio-informatique. Yanglei Yi et Li Zhibo sont pris en charge par le Conseil de bourse Chine (CSC). Nous remercions NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pour leur soutien financier à l’OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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