Desthiobiotin маркировка синтетических 25-нуклеотидов РНК oligo, который содержит элемент аденин-богатые люди (являются) мотив, позволяет конкретной привязки цитозольной являются связывающий белок.
В vitro РНК пулдаун до сих пор широко используется в первые шаги протоколов, направленных на выявление RNA-связывая протеинов, которые признают конкретных структур РНК и мотивы. В этом протоколе РНК пулдаун, коммерчески синтезированных РНК зонды помечены с измененной форме биотина, desthiobiotin, на станции 3′ strand РНК, который обратимо связывается с стрептавидина и таким образом позволяет элюции белков под более физиологических условий. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Метод, описанный здесь может применяться для определения взаимодействия между известных РНК связывания белков и 25-нуклеотидов (nt) длиной РНК зонд содержащий последовательность интереса. Это полезно для завершения функциональная характеристика стабилизации или дестабилизирующих элементов, присутствующих в молекулы РНК с помощью пробирного вектор репортер.
Экспрессии генов и последний уровень продукта гена могут жестко регулируется, влияющие на стабильность мРНК и мРНК перевод курса1. Эти post-transcriptional механизмы регулирования оказывается через взаимодействие некодирующих РНК и/или RNA-связывая протеинов (ОДП) с Целевая мРНК. Обычно это 3′ непереведенные регионе мРНК (3′ УТР – принадлежащие некодирующих часть генома2), содержащий конкретные СНГ-регуляторных элементов (КРР), которые распознаются транс-действующих факторов, таких как Мирна или ОДП 3. наиболее изученных стран СНГ-элемент внутри 3′ УТР, это аденин богатые элемент (являются) мотив, который распознается по конкретным AU-связывающих белков (AUBP) и, в свою очередь, индуцирует либо деградации мРНК/deadenylation (являются опосредованной распада) или мРНК стабилизации4.
Размер 3′ УТР из calretinin мРНК (CALB2) является 573 bp длинные и содержит предполагаемый AUUUA пентамера, как предсказано, AREsite2, инструмент bioinformatic5. В соответствии с наличием разоблачало это мотив, pmirGLO вектор репортер пробирного продемонстрировал роль по стабилизации этого элемента в мРНК CALB26. Наконец, в пробирке РНК пулдаун была использована для выявления AUBP, которая стабилизирует calretinin мРНК через являются мотивом.
Поскольку все некодирующих RNAs взаимодействуют белки7, в пробирке РНК пулдаун является хорошим способом и assay первого выбора для определения РНК посредники для помощи в расшифровке молекулярных механизмов. В этом методе РНК пулдаун коммерчески синтезированных РНК зондами, которые были помечены с измененной форме биотин (desthiobiotin) в отеле terminus 3′ стренги РНК, были использованы. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с граница РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Такие РНК прыгните белки являются этого eluted от магнитной бусины, запустить через гель SDS-PAGE 12%, переданы мембраны и исследован с различными антителами.
В процедуре очищения сродства стандартных стрептавидина биотин, суровых денатурации необходимые условия сорвать сильный необратимым биотин стрептавидина облигаций для элюировать связанных белков-8, который может привести к диссоциации белковых комплексов. В отличие от биотин desthiobiotin обратимо связывается с стрептавидина и конкурентоспособным перемещенных с буфферезированный раствор биотина, позволяя для нежный элюции белков и избежать изоляции естественно биотинилированным молекул9, Предполагая, что этот метод идеально подходит для изоляции родной белковых комплексов в родной условиях.
В vitro условий привязки и жесткости, которые определяются концентрации соли, восстановителей и стиральный порошок процент, должна быть близка к присутствующим в сотовой связи для того, чтобы определить значение true в естественных условиях взаимодействия. Обязательного условия выполнены здесь были ранее продемонстрированы как пригодные для идентификации HuR как AU-связывания белков10. Этот подход мог бы сэкономить время, поскольку оптимизация условий надлежащего привязки может быть длительным и сложным. Кроме того этот метод может использоваться в качестве отправной протокол для любого эксперимента РНК пулдаун и постепенно может быть оптимизирована путем изменения концентрации солей и моющих средств, изменив процент отведенного под глицерина и добавления других солей. Кроме того мы показали, что даже короткий 25-нуклеотидов РНК зонд укрывательство пентамера являются мотив могут быть использованы для демонстрации взаимодействия с конкретным AUBP.
3′ необычных принадлежат некодирующих генома3, и все некодирующих РНК может взаимодействовать с белками для того чтобы приложить их функции7. Когда генома млекопитающих было установлено pervasively транскрипции и производится значительная часть длиной некодирующи…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Швейцарский Национальный фонд Синергия науки Грант CRSII3 147697, Stiftung für Krebsforschung изображения и Цюрих Krebsliga.
NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |