Desthiobiotin marquage d’un oligo synthétique de RNA 25 nucléotides, qui contient un motif élément riches adénine (ARE), permet la fixation spécifique de la protéine cytosolique sont.
Le in vitro RNA-menu déroulant est encore largement utilisé dans les premières étapes des protocoles visant à identifier des protéines de liaison à l’ARN qui reconnaissent les structures d’ARN spécifiques et les motifs. Dans ce protocole de RNA-pulldown, sondes d’ARN synthétisés dans le commerce sont étiquetés avec une forme modifiée de la biotine, desthiobiotin, à l’extrémité 3′ du brin d’ARN, qui lie réversiblement streptavidine et ainsi permet d’élution des protéines sous plus physiologique conditions. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas de protéines qui interagissent spécifiquement avec l’ARN d’intérêt. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. La méthode décrite ici peut être appliquée pour détecter l’interaction entre les protéines de liaison ARN connues et une sonde RNA longue de 25 nucléotides (nt) contenant une séquence d’intérêt. Ceci est utile pour compléter la caractérisation fonctionnelle de stabiliser ou déstabiliser les éléments présents dans les molécules d’ARN obtenus avec un dosage de vecteur de journaliste.
L’expression des gènes et le niveau final du produit du gène peuvent être étroitement contrôlées en affectant la stabilité de l’ARNm et l’ARNm traduction taux1. Ces mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont exercent à travers les interactions des protéines de RNA et/ou de liaison à l’ARN non codants (pratiques commerciales restrictives) avec l’ARNm ciblés. C’est généralement la région non traduite en 3′ de l’ARNm (3′ UTR – appartenant à la partie non codantes du génome2) qui contient des cis-éléments de régulation (CRE), qui sont reconnus par trans-agissant de facteurs tels que miRNA ou de pratiques commerciales restrictives 3. les mieux étudiés cis-élément au sein de la région 3′ UTR, est le motif de l’élément riches adénine (ARE), qui est reconnu par les protéines de liaison AU spécifiques (AUBP) et, à son tour, induit un ARNm dégradation/désadénylation (sont-mediated decay) ou sur la stabilisation de l’ARNm4.
La taille de la région 3′ UTR de calretinin (CALB2) d’ARNm est 573 bp long et contient un pentamère AUUUA putatif, tel que prédit par AREsite2, un outil de bioinformatic5. Compatibles avec la présence d’un motif sont présumé, le dosage de vecteur-journaliste de pmirGLO ont démontré un rôle dans la stabilisation de cet élément au sein de l’ARNm de CALB26. Enfin, l’ in vitro RNA-menu déroulant servait à identifier le AUBP qui stabilise calretinin ARNm à travers le motif sont.
Étant donné que toutes les ARN non codants interagissent avec les protéines7, l’ in vitro RNA-menu déroulant est un bon moyen et des tests de première de choix pour identifier les RNA-Interactiens afin d’aider à décrypter les mécanismes moléculaires. Dans cette méthode de RNA-menu déroulant, des sondes d’ARN synthétisés dans le commerce, qui ont été marquées avec une forme modifiée de biotine (desthiobiotin) à l’extrémité 3′ du brin d’ARN, ont été utilisés. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas qui interagir spécifiquement avec l’ARN d’intérêt lié aux protéines. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. Ces protéines liées à RNA sont éluées de billes magnétiques, courir à travers un gel SDS-PAGE de 12 %, transféré sur une membrane et sondés avec anticorps différents.
Dans la procédure de purification d’affinité standard streptavidine-biotine, dénaturation rude conditions sont requises pour perturber la liaison streptavidine-biotine forte irréversible pour éluer les protéines liées8, qui pourrait conduire à la dissociation de complexes protéiques. Contrairement à la biotine, desthiobiotin réversible se lie à la Streptavidine et est déplacé de façon compétitive avec une solution tampon de biotine, permettant l’élution douce des protéines et d’éviter l’isolement des naturellement biotinylé molécules9, ce qui suggère que la technique est idéale pour isoler les complexes de protéine native sous conditions natives.
In vitro les conditions de la liaison et rigueur, qui sont déterminés par la concentration en sel, agents réducteurs et pourcentage de détergent, devraient être proches de celles présentes dans le contexte cellulaire afin d’identifier les véritables in vivo des interactions. Les conditions de liaison mis en place dans les présentes ont été démontrées précédemment en fonction de l’identification de la HuR comme une protéine de liaison AU10. Cette approche pourrait gagner du temps, étant donné que l’optimisation des conditions de liaison approprié peut être long et difficile. En outre, cette méthode pourrait être utilisée comme un protocole de départ pour toute expérience de RNA-menu déroulant et optimiser progressivement en changeant la concentration des sels et des détergents, en modifiant le pourcentage de glycérol et en ajoutant autres sels. En outre, nous avons démontré que même une courte 25 nucléotides RNA-sonde contenant un pentamère sont-motif pourrait servir à démontrer l’interaction avec un AUBP spécifique.
3′ UTR appartiennent à la non codantes du génome3, et tous les ARN non codants peut interagir avec des protéines afin d’exercer leur fonction7. Quand le génome des mammifères s’est avéré être une transcription de l’acte et produit une grande partie du long non codantes ARN16, nouvelles preuves ont démontré que ces ARN non-codants-long fonctionne dans la régulation de l’expression des gènes qui interagissent avec remodelage de la c…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l’octroi de Swiss National Science Foundation Sinergia CRSII3 147697, la Stiftung für Angewandte Krebsforschung et Zürich Krebsliga.
NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |