Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.
Die in-vitro- RNA-Pulldown wird noch weitgehend verwendet in den ersten Schritten der Protokolle, die auf die Identifizierung von RNA-bindende Proteine, die spezifisch RNA-Strukturen und Motive zu erkennen. In diesem Protokoll RNA-Pulldown kommerziell synthetisierte RNA-Sonden sind beschriftet mit einer modifizierten Form von Biotin, Desthiobiotin, an das 3′ Ende der RNA-Strang, die reversibel bindet an Streptavidin und ermöglicht somit Elution von Proteinen unter mehr physiologische Bedingungen. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der RNA des Interesses interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Die hier beschriebene Methode kann angewendet werden, um die Interaktion zwischen bekannten RNA-bindende Proteine und eine 25-Nukleotid (nt) lange RNA-Sonde mit einer Sequenz von Interesse zu erkennen. Dies ist nützlich, um die funktionelle Charakterisierung der stabilisieren oder destabilisieren Elementen in RNA-Moleküle mit einem Reporter-Vektor-Assay erreicht abzuschließen.
Genexpression und die letzte Stufe des genprodukts können streng reguliert werden, durch Einwirkung auf die Stabilität der mRNA und mRNA Übersetzung Satz1. Diese Posttranskriptionale Regulationsmechanismen sind durch die Wechselwirkungen von nicht-kodierende RNA und/oder RNA-bindende Proteine (RBPs) mit gezielten mRNA ausgeübt. Es ist in der Regel 3′ untranslatierten Region der mRNA (3′ UTR – gehören zu den nicht-kodierenden Teil des Genoms2), die spezifische Cisenthält-regulatorischen Elementen (CRE), die von Transerkannt werden-wirkenden Faktoren wie MiRNA oder RBPs 3. der am besten untersuchten Cis-Element innerhalb der 3′ UTR, ist die Adenin-HTML-Elements (sind)-Motiv, das durch spezifische AU-bindende Proteine (AUBP), und dies wiederum erkannt wird, induziert entweder mRNA Abbau/Deadenylation (sind vermittelte Zerfall) oder mRNA-Stabilisierung-4.
Die Größe der 3′ UTR von Calretinin ist mRNA (CALB2) 573 bp lang und enthält eine vermeintliche AUUUA-pentamère wie von AREsite2, einem Bioinformatic Hilfsmittel5vorhergesagt. In Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines vermeintlichen sind Motivs, Rolle unter Beweis gestellt PmirGLO Vektor-Reporter Assay eine Stabilisierung dieses Elements innerhalb CALB2 mRNA-6. Zu guter Letzt die in Vitro RNA-Pulldown wurde verwendet, um die AUBP zu identifizieren, die Calretinin stabilisiert mRNA durch das Motiv sind.
Da alle nicht-kodierende RNAs mit Proteinen7interagieren, ist der in-vitro- RNA-Pulldown ein guter Weg und erste Wahl-Test zur Identifizierung von RNA-Interaktoren zur Unterstützung bei der Entschlüsselung der molekularer Mechanismen. Bei diesem RNA-Pulldown-Verfahren wurden kommerziell synthetisierte RNA-Sonden, die mit einer veränderten Form von Biotin (Desthiobiotin) an das 3′ Ende der RNA-Strang gekennzeichnet wurden, verwendet. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der gebundenen RNA von Interesse interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Diese RNA-gebundene Proteine sind von der magnetischen Beads, durchlaufen eine 12 % SDS-PAGE Gel auf eine Membran übertragen und sondiert mit verschiedenen Antikörpern eluiert.
In der standard Streptavidin-Biotin-Affinität Reinigungsprozedur, rauen Denaturierung, die Voraussetzungen erforderlich sind, um die starke irreversible Biotin-Streptavidin-Anleihe um die gebundenen Proteine8eluieren stören die zur Dissoziation von führen könnten Proteinkomplexe. Im Gegensatz zu Biotin Desthiobiotin reversibel bindet an Streptavidin und wird mit einer gepufferten Lösung von Biotin, zulassend die sanfte Elution von Proteinen und die Vermeidung von der Isolation natürlich biotinylierte Moleküle9kompetitiv verdrängt, was darauf hindeutet, dass die Technik ideal für systemeigene Proteinkomplexen unter heimischen Bedingungen zu isolieren.
In-vitro- verbindliche Auflagen und Stringenz, die Salzkonzentration, Reduktionsmittel und Waschmittel Prozentsatz ermittelt werden, sollte in der Nähe von den anwesenden im Zusammenhang mit zellulären, um wahre in Vivo Interaktionen zu identifizieren. Die verbindlichen Bedingungen hierin umgesetzt wurden zuvor als angemessen für die Identifizierung der HuR als eine AU-bindende Protein10nachgewiesen. Dieser Ansatz könnte Zeit zu sparen, da die Optimierung der richtige Bindung Bedingungen zeitaufwändig und anspruchsvoll sein kann. Darüber hinaus ist diese Methode könnte als Ausgangspunkt Protokoll für jedes Experiment RNA-Pulldown verwendet werden und kann durch Veränderung der Konzentration von Salzen und Reinigungsmittel, Ändern des Glycerin-Anteils und andere Salze schrittweise optimiert werden. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass sogar eine kurze 25-Nukleotid RNA-Sonde beherbergen ein pentamère sind-Motiv verwendet werden, um Interaktion mit einer spezifischen AUBP zu demonstrieren.
3′ wo gehören die nicht-kodierenden Genom3, und alle nicht-kodierende RNAs können mit Proteinen interagieren, um ihre Funktion7ausüben. Wenn das Säugetier-Genom wurde festgestellt, dass durchdringend transkribiert werden und einen Großteil der lange Forensisches RNAs16 produziert, neue Beweise gezeigt, dass diese lange Forensisches RNAs in der Genexpression regulieren, wie sie interagieren funktionieren Chromatin-Umbau komplexe…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation Sinergia Grant CRSII3 147697, die Stiftung Für Angewandte Krebsforschung und Zürich Krebsliga unterstützt.
NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |