Desthiobiotin rotulagem de um sintético 25-nucleotide oligo de RNA, que contém um motivo de adenina-rico elemento (são), permite a ligação específica da proteína de ligação são citosólica.
O em vitro RNA-pulldown é ainda amplamente usado nos primeiros passos de protocolos que visam identificar RNA-proteínas que reconhecem estruturas de RNA e motivos específicos. Neste protocolo de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente são rotuladas com uma forma modificada de biotina, desthiobiotin, no terminal 3′ da strand, RNA, que se liga reversivelmente para streptavidin e permite assim a eluição das proteínas sob mais fisiológica condições. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar a interação entre proteínas de ligação de RNA conhecidas e uma 25-nucleotide (nt) longo RNA sonda contendo uma sequência de interesse. Isso é útil para completar a caracterização funcional de estabilização ou desestabilizar os elementos presentes em moléculas de RNA alcançadas usando um ensaio de vetor de repórter.
Expressão gênica e o nível final do produto do gene podem ser fortemente regulamentados por afetar a estabilidade do mRNA e o mRNA tradução taxa1. Estes mecanismos de regulação pós-transcricional são exercidos através de interações de não-codificantes do RNA e/ou ligação de RNA proteínas (RBPs) com mRNA alvo. Geralmente é a região untranslated 3′ do mRNA (3′ UTR – pertencentes à porção não-codificantes do genoma2) que contém específica cis-elementos reguladores (CRE), que são reconhecidos pelo trans-agindo fatores como miRNA ou RBPs 3. o mais bem estudadas cis-elemento dentro do 3′ UTR, é motivo de adenina-rico elemento (são), que é reconhecido por proteínas específicas de AU-ligação (AUBP) e, por sua vez, induz qualquer degradação do mRNA/deadenylation (decaimento são-mediada) ou de estabilização do mRNA4.
O tamanho da 3′ UTR de desnutridos mRNA (CALB2) é 573 bp longa e contém um pentâmero AUUUA putativo, como previsto pelos AREsite2, uma ferramenta de bioinformatic5. Consistente com a presença de um putativo são motivo, o ensaio de vetor-repórter pmirGLO demonstrado um papel de estabilização deste elemento dentro do mRNA CALB26. Finalmente, o em vitro RNA-pulldown foi usado para identificar a AUBP que estabiliza desnutridos mRNA através do motivo de são.
Desde que todos os RNAs não codificantes interagirem com proteínas7, o em vitro RNA-pulldown é um ensaio de primeira escolha para a identificação de RNA-interactianos e boa maneira para ajudar a decifrar os mecanismos moleculares. Neste método de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente, que foram rotuladas com uma forma modificada de biotina (desthiobiotin) no terminal 3′ da strand, RNA, foram usadas. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o limite-RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. Essas proteínas RNA-limite são eluídas dos grânulos magnéticos, executado através de um gel de SDS-PAGE 12%, transferido para uma membrana e sondado com anticorpos diferentes.
O procedimento de purificação padrão estreptavidina-biotina afinidade, dura desnaturação requeridas para romper o vínculo forte irreversível biotina-streptavidin para Eluir o limite proteínas8, que pode levar a dissociação de complexos de proteínas. Ao contrário de biotina, desthiobiotin reversível vincula streptavidin e competitivos é deslocada com uma solução tamponada de biotina, permitindo a eluição suave de proteínas e evitando o isolamento de naturalmente biotinilado moléculas9, sugerindo que a técnica é ideal para isolar os complexos da proteína nativa sob condições nativas.
In vitro as condições de vinculação e o rigor, que são determinados pela concentração de sal, agentes redutores e porcentagem de detergente, devem ser próximo aos presentes no contexto celular a fim de identificar interações de verdade na vivo . As condições de ligação implementadas neste documento foram anteriormente demonstradas conforme apropriado para a identificação da HuR como uma proteína ligadora AU10. Esta abordagem poderia poupar tempo, desde que a otimização das condições de vinculação adequada pode ser demorada e desafiador. Além disso, esse método poderia ser usado como um protocolo de partida para qualquer experiência de RNA-pulldown e pode ser otimizado progressivamente alterando a concentração de sais e detergentes, mudando a porcentagem de glicerol, e adicionando outros sais. Além disso, demonstrar que mesmo uma curta 25-nucleotídeo do RNA-sonda abrigando um pentâmero são-motivo poderia ser usado para demonstrar a interação com um específico AUBP.
3′ UTRs pertencem ao não-codificantes do genoma3, e todos os RNAs não codificantes podem interagir com as proteínas a fim de exercer sua função7. Quando o genoma de mamíferos foi encontrado para ser comodamente transcrito e produzido uma parcela significativa de tempo não-codificante RNAs16, emergentes evidências demonstraram que estes RNAs long-não-codificante função na regulação da expressão gênica como eles interagem com cromatina-r…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation Sinergia concessão CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.
NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |