同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療
Summary
実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS 解析に続いて単一細胞懸濁液を準備する解離。
Abstract
同種 (同系) の腫瘍は、今日の免疫・腫瘍学 (I/O) 臨床研究の主力製品です。腫瘍微小環境 (TME)、特に免疫-コンポーネントは予後との特にそれらの免疫療法の治療結果の予測に不可欠です。TME 免疫-コンポーネントは、マルチカラーの FACS による腫瘍浸潤の評価の免疫細胞のさまざまなサブセットの構成されます。膵管腺癌 (PDAC) は、良い治療法の選択肢、したがって、緊急と満たされていない医療ニーズを欠けている最悪の malignances の一つです。様々 な治療 (化学療法をターゲット、I/O) の非応答のための 1 つの重要な理由は、これらの治療から腫瘍細胞を守る白血球や線維芽細胞から成る、その豊富な TME をされています。注入 PDAC より正確に考えられているがんは、皮下 (SC) 従来よりも人間の膵臓癌の TME を奪還します。
同種腫瘍 (KPC) は、遺伝子組み換え KPC マウスから発信されたマウス自発 PDAC の移植 (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-再C) (KPC ジェム)。腫瘍組織は小さな断片 (~ 2 mm3) にカットし、皮下移植 (SC) (C57BL/6、7-9 週齢) の同系の受信者に。移植手術していたがんと一緒に SC 注入、17 日まで 300-1,000 mm3の腫瘍体積の新しい c57bl/6 マウスの膵臓に移植しました。400-600 mm3の腫瘍だけは承認された解剖プロシージャごとに収穫され、きれいに隣接する非腫瘍性組織を削除します。単一細胞懸濁液、異なる免疫細胞の様々 なマーカーの蛍光標識抗体の指定されたパネルとの汚損によって続いてに組織発生器を使用してプロトコルごと解離彼ら (リンパ球、骨髄性 NK、DCs)。ステンド グラス サンプルの腫瘍内での相対的な割合と同様、異なる系統の免疫細胞の数を決定するマルチカラー FACS を用いていた。同所性同種腫瘍の免疫プロファイルは SC 腫瘍のものと、比較しました。予備的なデータは、膵臓と SC の腫瘍ではなく、同所性同種に高い B 細胞浸潤腫瘍の浸潤なティルズ/Tam を有意に上昇を示した。
Introduction
膵管腺癌 (PDAC) ほぼ半分百万死亡世界中毎年トップ 5 がんキラーの 1 つが発生します。いくつかの効果的な治療オプションとも承認された免疫療法;したがって、新しい治療法が必死に必要です。癌は、今日知られている遺伝的疾患に加えて PDAC を含む免疫疾患として認識され始めています。病の予後と治療免疫学的および遺伝的要因を決定可能性が高い結果。腫瘍は、ホスト免疫監視を回避して最終的に死を引き起こすに進みます。多くのこれらの免疫プロセス内で発生する腫瘍微小環境 (TME)1,2,3,4異なったタイプの免疫細胞が腫瘍細胞、互いおよび他の腫瘍を対話間質成分は、直接または間接的を介してサイトカイン疾患の結果を最終的に決定します。したがって、TME、または腫瘍診療、サブタイプ、記数法の免疫細胞の異なる系統のローカリゼーションなどの腫瘍免疫成分の特性は、抗腫瘍免疫を理解する重要です。PDAC、場合それを提案されている腫瘍浸潤抑制マクロファージ (TAM) を昇格して、B 細胞は T 細胞の浸潤や活性化の防止や線維症5,6の高いレベルにつながっています。
実験的免疫手ごろを調査する一般的なアプローチは、サロゲート腫瘍臨床モデル動物を用いたが、主に関連するマウス腫瘍モデル7、特にマウス同系 (同種) または遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム)がんのマウスおよび腫瘍および免疫8,9に対するヒトの想定された類似性に。それが現実でわかる 2 種10,11の間の本質的な違いがあること。
マウスの移植腫瘍自発腫瘍7、親のジェム自発腫瘍開発と対照をなして、すなわち同期腫瘍開発上重要な操作上の利点があります。マウス腫瘍の移植であることのなかった原発操作の in vitro、・ ミラーリング オリジナル マウス腫瘍病理組織/分子病理7、として可能性のある免疫プロファイル。多くの場合、これらのマウスの移植は「患者由来の異種移植片 (PDXs) のマウス バージョン」と見なされます。彼らしたがって可能性が高い従来の同系細胞由来のマウス腫瘍12より良い翻訳可能性があります。特に、多くの移植は、特定疾病のメカニズム、例えば発癌ドライバー変異、設計、これらの移植がその臨床的意義への利点必要したがって、特定のジェムから派生されます。特に、KPC ジェムは年齢、形態学的主にも-に分化腺アーキテクチャと人間の病気を繰り返すし、間質を高濃縮の 15-20 週間以内マウス PDAC を開発します。このモデルは、人間 PDAC、すなわち Kras 変異および P53 の機能喪失、人間 PDAC、それぞれ5,6の 75% と 90% で発生するアクティブ化の最も一般的な遺伝的特徴をまた繰り返します。
移植のサイトはモデル訳しで役割を果たすことも提案されています。対応する同所性同種環境など、特定の周囲組織環境は一般的移植腫瘍の進行状況、制服の皮下 (SC) とは対照的環境に特定の腫瘍のためのニッチかもしれない。特別な関心のであろう場合、および/または、どのような違いは例えば免疫-微小環境とひと癌との関連性の面で、2 つの移植サイト間に存在します。場合 PDAC。
免疫プロファイルや診療の最も重要な側面の一つは、異なる系統、数字、腫瘍の中で相対的な割合と同様、彼らのアクティベーション状態、および場所の腫瘍浸潤の免疫細胞を決定します。これは腫瘍 infiltratrating lymphoctyes が含まれています (ティルズ、両方の T – と B-)、(Tam) 腫瘍浸潤マクロファージ、ナチュラル キラー細胞の腫瘍浸潤 (NKs) と腫瘍居住者樹状細胞3,13,14,15,16,17、および特定の細胞18,19,20等の細胞内局在。蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) または流れの cytometry はセルの特定のパラメーターを測定する一般的使用される単一細胞検出技術です。マルチカラー流れの cytometry 措置単一のセル3,4,21日複数のマーカーと数字と免疫細胞のさまざまなサブセットの相対的な割合を決定する最も一般的に使用される方法です。腫瘍を含みます。
このレポートは、免疫細胞の腫瘍浸潤のプロファイリングの手順を説明します: 1) 同所性同種 PDAC マウス腫瘍移植、SC 注入; と共にの注入2) 腫瘍組織の収穫と腫瘍解離を介して単一のセル準備3) 流フローサイトメトリー解析; ベースラインとして腫瘍由来細胞のすべての4) 移植両方のベースライン プロファイルの比較。
Protocol
Representative Results
Discussion
SC 腫瘍を用いた研究を行いやすくが移植がん腫瘍モデルすることができます潜在的臨床薬理試験 (特に I/O 調査) の関連性の高い強化翻訳対象範囲を提供します。このレポートは、直接彼らのそれぞれの研究で使用できる技術的な手順を視覚化できるように興味がある読者/視聴者の支援を目指しています。私達のプロトコルを示すその同所性同種 PDAC の注入が効率的な腫瘍の成長、SC 注入のよ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者博士ジョディ Barbeau – 重要な読書と原稿の編集、ありがとうと芸術作品を設計するためラルフ ・ マヌエルを感謝思います。著者もクラウン生命科学腫瘍免疫腫瘍マーカー チームとがんのIn Vivoチームの素晴らしい技術的な努力に感謝を思います。
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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