免疫分型小鼠原位 PDAC homografts 的实验程序旨在分析肿瘤免疫微环境。肿瘤通过手术原位植入。200–600毫米3的肿瘤被收获和分离, 以制备单细胞悬浮液, 然后使用不同的荧光标记抗体进行多免疫标记物的分析。
同种异体 (自体) 肿瘤是当今免疫肿瘤学 (i/o) 临床前研究的主力。肿瘤微环境, 特别是其免疫成分, 对于预后和预测治疗结果, 尤其是免疫疗法是至关重要的。免疫成分由多色流化物所应课税的肿瘤浸润免疫细胞的不同亚群组成。胰导管腺癌 (PDAC) 是最致命的恶性肿瘤之一, 缺乏良好的治疗方案, 因此迫切和未满足的医疗需求。其对各种治疗方法 (化疗、靶向、i/o) 不反应的一个重要原因是它的丰富, 由成纤维细胞和白细胞组成, 保护肿瘤细胞免受这些疗法的侵害。原位植入 PDAC 被认为比传统的皮下 (SC) 模型更准确地夺回人胰腺癌的发病率。
同种异体肿瘤 (kpc) 是移植的小鼠自发 PDAC 起源于基因工程的 KPC-小鼠 (KrasG12D/+/P53-/Pdx1-C) (kpc-GEMM)。原发肿瘤组织被切割成小片段 (2 毫米3), 并移植皮下 (SC) 到自体接受者 (C57BL/6, 7–9周岁)。homografts 的手术原位移植到新的 C57BL/6 小鼠的胰腺, 连同 SC 植入, 达到300–1,000 毫米3的肿瘤体积17天。只有400–600毫米3的肿瘤是根据经批准的尸检程序获得的, 并清理清除相邻的非肿瘤组织。它们被分离每协议使用组织 dissociator 入单细胞悬浮, 然后染色与指定的小组荧光标记抗体为不同的免疫细胞标记 (淋巴, 髓体并且 NK, DCs)。用多种颜色的方法对染色样品进行了分析, 以确定不同血统的免疫细胞数量以及肿瘤内的相对比例。然后将原位肿瘤的免疫剖面与 SC 肿瘤进行比较。初步数据显示, 胰腺肿瘤浸润 TILs/TAMs 明显升高, B 细胞浸润至原位而非 SC 型肿瘤。
胰腺导管腺癌 (PDAC) 导致近100万死亡率全球每年, 其中一个前5个癌症杀手。没有有效的治疗方案, 也没有批准的免疫疗法;因此, 迫切需要新的治疗方法。除了今天已知的基因疾病外, 癌症越来越被公认为免疫学疾病, 包括 PDAC。免疫学和遗传因素可能决定疾病的预后以及治疗结果。肿瘤逃避宿主免疫监测, 最终导致死亡。其中许多免疫过程发生在肿瘤微环境中 (1,2,3,4 ), 其中不同类型的免疫细胞相互作用与肿瘤细胞, 彼此和其他肿瘤基质成分, 直接或间接通过细胞因子最终决定疾病结局。因此, 肿瘤免疫成分的免疫分型, 或肿瘤, 包括子类型), 计数和定位的不同血统的免疫细胞, 是至关重要的, 以了解抗肿瘤免疫。在 PDAC 的情况下, 提出了高肿瘤浸润抑制巨噬细胞 (TAM) 和 B 细胞已导致预防 T 细胞浸润和/或活化和高水平的纤维化5,6。
研究免疫巴掌就的常用方法是使用代孕瘤前动物模型, 主要是相关的小鼠肿瘤模型7, 特别是小鼠自体 (同种异体) 或基因工程鼠模型 (GEMM)癌症的假设相似性的老鼠和人的肿瘤和免疫8,9。事实上, 这两个物种之间存在着内在的差异,10,11。
移植小鼠肿瘤具有显著的手术优势优于自发性肿瘤7, 即同步肿瘤的发展, 与父母 GEMM 自发性肿瘤的发展形成对照。Homografts 的自发性小鼠肿瘤被认为是原发肿瘤从未纵的体外, 并镜像原鼠肿瘤历史 – / 分子病理7, 以及可能的免疫剖面。这些小鼠 homografts 通常被认为是 “一个老鼠版本的病人衍生的移植 (PDXs)”。因此, 它们有可能比传统的自体细胞线衍生的小鼠肿瘤有更好的可译性12。特别是, 许多 homografts 来自特定的 GEMM, 其中具体的人类疾病机制,如致癌驱动因素突变, 被设计, 这些 homografts 应该有优势, 其临床相关性。特别是, KPC GEMM 在15–20周的年龄内开发小鼠 PDAC, 这在形态学上概括人类疾病, 主要是适度分化的腺结构和高度丰富的基质。该模型还概括人类 PDAC 最常见的遗传特征, 即 Kras 激活突变和 P53 功能丧失, 这在人类 PDAC 的90% 和75% 分别发生5、6。
移植部位也被建议在模型可译性中发挥作用。特定的周围组织环境, 如相应的原位环境, 可能是特定肿瘤进展的利基, 而不是一般移植肿瘤的均匀皮下 (SC) 环境。这将是特别感兴趣的, 如果和/或, 有什么区别, 在两个移植地点之间的免疫微环境, 以及与人类癌症的相关性, e.在 PDAC 的情况下。
免疫分析的一个最重要的方面, 或免疫分型, 是确定肿瘤浸润免疫细胞的不同血统, 数量, 相对比例的肿瘤, 以及他们的活化状态, 和地点。这包括肿瘤-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T 和 B), 肿瘤浸润巨噬细胞 (TAMs), 肿瘤浸润自然杀伤干细胞 (NKs) 和肿瘤驻留的树突状细胞3,13,14,15,16,17、以及某些细胞在18、19、20等区域的局部定位。荧光活化细胞分选法或流式细胞仪是一种单细胞检测技术, 通常用于测量细胞的特定参数。多色流式细胞仪测量单个细胞3、4、21的多个标记, 是确定不同免疫细胞子集的数量和相对百分比的最常用方法,包括肿瘤内的那些。
本报告描述了肿瘤浸润免疫细胞的分析程序: 1) 原位 PDAC 小鼠肿瘤 homografts 的植入, 以及 SC 植入;2) 肿瘤组织的收获和单细胞的分离制备;3) 以肿瘤为基线的所有细胞的流式细胞仪分析;4) 两种移植方法基线剖面的比较。
虽然使用 SC 肿瘤的研究更容易进行, 原位植入肿瘤模型可能会更相关的临床前药理学研究 (特别是 i/o 调查), 以提供增强的可译性。本报告旨在帮助感兴趣的读者/读者能够直接可视化的技术程序, 可用于其各自的研究。我们的协议表明, 原位植入 PDAC 可以导致有效的肿瘤生长, 类似于 SC 植入。我们的观察似乎也表明, 不同植入的巴掌就存在不同的免疫剖面。与 SC 植入相比, 适应原位的主要挑战是需?…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢朱迪 Barbeau 博士对手稿的批判性阅读和编辑, 感谢拉尔夫?曼努埃尔设计艺术品。作者还要感谢皇冠生物科学肿瘤免疫肿瘤生物标志组和肿瘤学在体内的团队, 为他们的伟大的技术努力。
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
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eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
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