De experimentele procedure op de immunophenotyping van lymfkliertest orthotopic PDAC homografts is gericht op de profilering van de tumor immuno-communicatie. Tumoren zijn orthotopically geïmplanteerd via chirurgie. Tumoren van 200 – 600 mm3 in grootte werden geoogst en losgekoppeld om te bereiden eencellige schorsingen, gevolgd door multi immuun marker FACS analyse met behulp van verschillende fluorescently gelabelde antilichamen.
Homograft (syngeneic) tumoren zijn het werkpaard van hedendaagse immuno-oncologie (I/O) preklinisch onderzoek. De tumor communicatie (TME), met name de immuun-componenten, is essentieel voor de prognose en de voorspelling van de resultaten van de behandeling, met name die van immunotherapie. TME immuun-componenten bestaan uit verschillende subgroepen van tumor-infiltreren immuuncellen verifieerbare door Multi-Color FACS. Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een van de dodelijkste malignances goede behandelingsmogelijkheden, dus een dringende en onvervulde medische noodzaak ontbreekt. Een belangrijke reden voor de niet-ontvankelijkheid aan verschillende therapieën (chemo-, doelgerichte, I/O) geweest zijn overvloedige TME, bestaande uit fibroblasten en leukocyten, die tumorcellen tegen deze therapieën beschermen. Orthotopically geïmplanteerde PDAC wordt beschouwd als meer nauwkeurig heroveren de TME van menselijke alvleesklier kanker dan conventionele onderhuidse (SC) modellen.
Homograft tumoren (KPC) zijn transplantaties van muis spontane PDAC van oorsprong uit genetisch gemanipuleerde KPC-muizen (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). De primaire tumor weefsel is gesneden in kleine fragmenten (~ 2 mm3) en getransplanteerde subcutaan (SC) aan de syngeneic ontvangers (C57BL/6, 7-9 weken oud). De homografts werden vervolgens operatief orthotopically getransplanteerd naar de alvleesklier van nieuwe C57BL/6 muizen, samen met SC-implantatie, die tumor volumes van 300 – 1.000 mm3 bereikbaar 17 dagen. Alleen tumoren van 400-600 mm3 werden geoogst per goedgekeurde autopsie procedure en gereinigd om te verwijderen van de aangrenzende weefsels van de niet-tumor. Ze waren losgekoppeld per protocol gebruikt een dissociator weefsel in eencellige schorsingen, gevolgd door de kleuring met aangewezen panelen van fluorescently gelabelde antilichamen voor verschillende markers van verschillende immuuncellen (lymfoïde, myeloïde en NK, DCs). De gekleurde monsters werden geanalyseerd met Multi-Color FACS te bepalen aantal immuuncellen van verschillende geslachten, alsmede het relatieve aandeel ervan binnen tumoren. De immuun profielen van orthotopic tumoren werden vervolgens vergeleken met die van SC tumoren. De voorlopige gegevens aangetoond aanzienlijk verhoogde infiltreren TILs/TAMs tumoren in de alvleesklier, en hogere infiltratie van de B-cel in de orthotopic in plaats van SC tumoren.
Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) zorgt ervoor dat bijna de helft een miljoen sterfgevallen wereldwijd jaarlijks, een van de top 5 kanker moordenaars. Er zijn enkele effectieve behandelingsopties en geen goedgekeurde immuuntherapie; nieuwe behandelingen zijn dan ook hard nodig. Kankers worden steeds meer erkend als immunologische ziekten, met inbegrip van PDAC, naast de genetische ziekten zoals bekend vandaag. Immunologische en genetische factoren zou waarschijnlijk bepalen prognose van de ziekte, alsmede de behandeling uitkomsten. Tumoren host immuun toezicht ontduiken en uiteindelijk verder om te leiden tot de dood. Veel van deze immuun processen die zich voordoen in de communicatie van de tumor (TME)1,,2,,3,4 waar verschillende soorten immuuncellen interactie aangaan met de tumorcellen, met elkaar en met andere tumor stromale onderdelen, direct of indirect via cytokines die uiteindelijk ziekte uitkomst bepalen. Karakterisering van de componenten tumor immuun TME, of immunophenotyping van de tumor, met inbegrip van subtypering, nummering en lokalisatie van verschillende geslachten van immune cellen, is daarom cruciaal voor het begrip anti-tumor immuniteit. In het geval van PDAC, er is voorgesteld dat verhoogde tumor-infiltreren onderdrukkende macrofagen (TAM) en B-cellen hebben geleid tot de preventie van T-cel infiltratie en/of activering en hoge niveaus van fibrose5,6.
De gemeenschappelijke aanpak van immuun TMEs experimenteel onderzoek zou worden met behulp van surrogaat tumor preklinische diermodellen, voornamelijk relevante muis tumor modellen7, bijzonder muis syngeneic (homograft) of genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) van kanker, op de veronderstelde gelijkenis van muis en mens voor tumoren en immuniteit8,9. In werkelijkheid wordt ervan uitgegaan dat er inherente verschillen tussen de twee soorten10,11 zijn.
Getransplanteerde muis tumoren hebben aanzienlijke operationele voordelen ten opzichte van spontane tumoren7, namelijk gesynchroniseerde tumor ontwikkeling, in tegenstelling tot de ouderlijke GEMM spontane tumor ontwikkeling. Homografts van spontane lymfkliertest tumoren worden beschouwd als primaire tumoren heb nooit gemanipuleerd in vitroen mirroring originele muis tumor histo- / moleculaire pathologie7, evenals mogelijke immuun profielen. Deze lymfkliertest homografts worden vaak beschouwd als “een muis versie van patiënt-afgeleide xenografts (PDXs)”. Daarom hebben zij waarschijnlijk een betere vertaalbaarheid dan conventionele syngeneic cel lijn afkomstige muis tumoren12. In het bijzonder, zijn veel homografts afgeleid van specifieke GEMM waar specifieke ziekten bij de mens mechanismen, bijvoorbeeld oncogene stuurprogramma mutaties, zijn ontworpen, en deze homografts moet derhalve voordelen aan hun klinische relevantie. In het bijzonder, ontwikkelen KPC GEMM muis PDAC binnen 15 tot 20 weken van leeftijd, die morfologisch recapituleert ziekten bij de mens met overwegend goed – tot matig-gesplitste klierweefsel architectuur en hoogverrijkt stroma. Dit model ook recapituleert de meest voorkomende genetische kenmerken van menselijke PDAC, namelijk Kras activeren mutatie en P53 verlies-van-functie, die in 90% en 75% van de menselijke PDAC, respectievelijk5,6te voorkomen.
Sites van transplantatie hebben geopperd zijn een rol te spelen in model vertaalbaarheid. De specifieke omgeving weefsel, zoals een overeenkomstige orthotopic omgeving, zou een niche voor specifieke tumoren aan vooruitgang, in tegenstelling tot de uniforme onderhuidse (SC) omgevingen voor algemeen getransplanteerde tumoren. Het zou van bijzonder belang als, en/of, wat verschil bestaat tussen de twee sites van de transplantatie, in termen van immuun-communicatie, en de relevantie voor menselijke kanker, bv. in het geval van PDAC.
Een van de belangrijkste aspecten van immuun profilering, of immunophenotyping, is het bepalen van de tumor-infiltreren immune cellen van verschillende geslachten, de nummers, relatieve percentage binnen tumoren, evenals hun activering Staten en locaties. Dit omvat tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T- zowel B-), tumor-infiltreren macrofagen (TAMs), tumor-infiltreren natural killer cellen (NKs) en tumor-ingezeten dendritische cellen3,13,14 , 15 , 16 , 17en de subcellular localisatie van bepaalde cellen18,19,20, enz. Fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) of stroom cytometry is een eencellige detectietechnologie die wordt gebruikt bij het meten van de specifieke parameters van een cel. Multi-Color stroom cytometry maatregelen meerdere markeringen op een eencellige3,4,21 en is de meest gebruikte methode om te bepalen van de aantallen en de relatieve percentage van verschillende subgroepen van immune cellen, met inbegrip van die binnen tumoren.
Dit verslag beschrijft procedures voor profilering van tumor-infiltreren immuuncellen: 1) implantatie van orthotopic PDAC muis tumor homografts, samen met SC de implantatie; 2) tumor weefsel oogst en eencellige voorbereiding via tumor dissociatie; 3) stroom cytometry analyse van alle cellen afgeleid van tumoren als een baseline; 4) vergelijking van basislijn profielen van beide benaderingen van de transplantatie.
Hoewel studies met behulp van SC tumoren zijn gemakkelijker uitgevoerd, orthotopically geïmplanteerd tumoren modellen kunnen potentieel zijn relevanter voor preklinische farmacologie studies (met name I/O onderzoeken) te bieden verbeterde vertaalbaarheid. Dit verslag beoogt de interesse lezers/publiek om direct visualiseren de technische procedures die kunnen worden gebruikt in hun respectieve onderzoek te kunnen helpen. Onze protocollen aantonen dat orthotopic implantatie van PDAC kan leiden tot een efficiënte tumorgr…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zou Dr. Jody Barbeau – dank voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript, en Ralph Manuel bedanken voor het ontwerpen van kunstwerken. De auteurs ook bedank de kroon Bioscience oncologie Immuno-oncologie Biomarker team en oncologie In Vivo team, voor hun grote technische inspanningen.
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
knife handle | Jin zhong | J11010 | |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
Studylog software | Studylog | software | |
Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
RNAlater | Thermo | am7021 |