ويهدف الإجراء التجريبي في إيمونوفينوتيبينج هوموجرافتس بدك أورثوتوبيك مورين التنميط وورم المكروية-المناعية. الأورام أورثوتوبيكالي مزروع عن طريق الجراحة. أورام من 200 – 600 مم3 في حجم حصاد وفصلها بإعداد تعليق خلية واحدة، متبوعاً بعلامة متعددة محصنة ضد نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل باستخدام الأجسام المضادة المختلفة المسمى فلوريسسينتلي.
الأورام هوموجرافت (سينجينيك) هي العمود الفقري للبحوث السريرية المناعية-الأورام (الإدخال/الإخراج) اليوم. وورم المكروية (TME)، وبخاصة جهاز المناعة-مكوناته، أمر حيوي للتكهن والتنبؤ بنتائج العلاج، لا سيما تلك التي المناعي. TME المناعة-مكونات تتألف من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية التسلل إلى الورم قابلاً بنظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان. البنكرياس الأقنية غدية (بدك) من بين ماليجنانسيس الأكثر دموية التي تفتقر إلى خيارات العلاج الجيد، وبالتالي حاجة طبية ملحة والتي لم تلب بعد. وكان أحد الأسباب الهامة لعدم استجابته للعلاجات المختلفة (الكيماوي-، استهدفت، الإدخال/الإخراج) به TME وفيرة، تتكون من الخلايا الليفية والكريات البيضاء التي تحمي الخلايا السرطانية من هذه العلاجات. أورثوتوبيكالي بداك مزروع ويعتقد أن أكثر دقة استعادة TME سرطان البنكرياس البشرية من النماذج التقليدية (SC) تحت الجلد.
الأورام هوموجرافت (KPC) يتم زرع بالماوس عفوية بداك تنشأ من مؤسسة البترول الكويتية-الفئران المهندسة وراثيا (rasكG12D/+//Pdx1-53-/-فجإعادة) (الفيلق-جيمم). الأنسجة الورم الرئيسي هو مقطعة إلى أجزاء صغيرة (~ 2 مم3) وزرعها تحت الجلد (SC) إلى المستلمين سينجينيك (C57BL/6، 7 – 9 أسابيع من العمر). هوموجرافتس كانت في ذلك الحين جراحيا أورثوتوبيكالي زرعها على بنكرياس الفئران C57BL/6 الجديدة، جنبا إلى جنب مع اتفاقية استكهولم-غرس، الذي بلغ حجم الورم 300 – 1,000 ملم3 قبل 17 يوما. تحصد كل إجراء تشريح الجثة المعتمدة فقط من الأورام من 400 – 600 ملم3 وتنظيف لإزالة أنسجة الورم غير متجاورة. أنها تم فصلها كل بروتوكول استخدام ديسوسياتور أنسجة في تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ مع فريقي المعين المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة لعلامات مختلفة للخلايا المناعية المختلفة (اللمفاوية، النقوي ومن ناغورني كاراباخ، وحدات تحكم المجال Dc). تم تحليل عينات ملطخة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان لتحديد عدد الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، فضلا عن النسبة المئوية النسبية داخل الأورام. ثم قورنت لمحات محصنة من الأورام أورثوتوبيك لتلك الأورام اتفاقية استكهولم. أظهرت البيانات الأولية تيلس/تامس المتسللة مرتفعة إلى حد كبير في أورام البنكرياس، وأعلى ب-خلية تسلل إلى أورثوتوبيك بدلاً من الأورام اتفاقية استكهولم.
أسباب غدية البنكرياس الأقنية (بدك) ما يقرب من نصف مليون حالة وفاة على نطاق عالم سنوياً، واحد من القتلة السرطان أعلى 5. وهناك عدد قليل من الخيارات العلاج الفعال ولا إيمونوثيرابيس المعتمدة؛ ولذلك، تمس الحاجة إليها العلاجات الجديدة. تحظى باعتراف سرطانات متزايد كالأمراض المناعية، بما في ذلك بدك، بالإضافة إلى الأمراض الوراثية المعروفة اليوم. سوف المحتمل أن تحدد العوامل المناعية والوراثية تشخيص المرض، فضلا عن معالجة النتائج. أورام التهرب من مراقبة المضيف المناعية والمضي قدما في نهاية المطاف للتسبب في الموت. تحدث العديد من هذه العمليات المناعية داخل ورم المكروية (TME)1،2،،من34 حيث أنواع مختلفة من الخلايا المناعية تتفاعل مع الخلايا السرطانية، مع بعضها البعض ومع غيرها الورم مكونات stromal، مباشرة أو غير مباشرة عن طريق السيتوكينات التي تحدد في نهاية المطاف نتيجة المرض. ولذلك توصيف مكونات الورم المناعي TME، أو الورم إيمونوفينوتيبينج، بما في ذلك subtyping، والعد، وتعريب الأنساب مختلفة من الخلايا المناعية، أمر بالغ الأهمية لفهم الحصانة المضادة للورم. وفي حالة بدك، فقد اقترح أن مرتفعة الضامة القمعية التسلل إلى الورم (TAM) والخلايا البائية أدت إلى منع تسلل خلايا T و/أو التنشيط، ومستويات عالية من التليف5،6.
نهج مشترك للتحقيق تميس المناعي تجريبيا باستخدام مركب الأورام السريري نماذج حيوانية، والورم الماوس ذات الصلة أساسا نماذج7، لا سيما الماوس سينجينيك (هوموجرافت) أو نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمم) من أمراض السرطان، في تشابه المفترضة للماوس والإنسان للأورام وحصانة8،9. ومن المفهوم في الواقع أن هناك اختلافات المتأصلة بين نوعين من أنواع10،11.
أورام الماوس زرع لها مزايا تشغيلية كبيرة أكثر أورام عفوية7، إلا وهي التنمية الورم متزامنة، على النقيض من وضع الورم عفوية جيم الأبوية. تعتبر هوموجرافتس أورام مورين عفوية الأورام الأولية وجود قط التلاعب في المختبر، والنسخ المتطابق الأصلي الماوس الورم histo-/الجزيئية الباثولوجيا7، فضلا عن ملامح محصنة ممكن. وكثيراً ما تعتبر هذه هوموجرافتس مورين “إصدار ماوس من تكثيفها المستمدة من المريض (بدكسس)”. ولذلك لديهم احتمالاً طواعية أفضل من الخلية سينجينيك التقليدية المستمدة من خط الماوس الأورام12. على وجه الخصوص، هوموجرافتس كثيرة مستمدة من جيم محددة حيث تم تصميم آليات محددة من الأمراض البشرية، مثل الطفرات النمطان السائق، ولذلك ينبغي أن هوموجرافتس هذه المزايا لأهميتها السريرية. على وجه الخصوص، جيم فيلق حماية كوسوفو وضع الماوس بدك ضمن 15 – 20 أسبوعا عمر، الذي يلخص شكلياً الأمراض البشرية مع بنية غدي جيدا-باعتدال-متباينة يغلب عليها الطابع والتخصيب سدى. ويجمل هذا النموذج أيضا السمات الوراثية الأكثر شيوعاً للبشرية بداك، هما كراس تفعيل P53 الخسارة من وظيفة، والطفرات التي تحدث في 90% و 75% من البشرية بداك، على التوالي5،6.
مواقع لزرع الأعضاء اقترح أيضا أن تلعب دوراً في نموذج طواعية. البيئة الأنسجة المحيطة محددة، مثل بيئة أورثوتوبيك مقابلة، يمكن أن تكون مكاناً للأورام المحددة إلى البيئات التقدم، بدلاً من موحدة تحت الجلد (SC) للأورام شيوعاً زرع. وسيكون من مصلحة خاصة إذا، و/أو، ما هو الفرق القائم بين موقعين الزرع، من حيث المناعة-المكروية، وأهمية بالنسبة للسرطان البشري، على سبيل المثال. وفي حالة بدك.
أحد الجوانب الأكثر أهمية للتنميط المناعي، أو إيمونوفينوتيبينج، تحديد التسلل إلى ورم الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، الأرقام، النسبة المئوية النسبية داخل الأورام، فضلا عن تفعيل الدول والمواقع. وهذا يشمل ليمفوكتييس ورم-إينفيلتراتراتينج (تيلس، سواء من تي-وب-)، التسلل إلى الورم الضامة (تامس) والتسلل إلى ورم الخلايا القاتلة الطبيعية (NKs) والورم المقيم الجذعية الخلايا3،،من1314 , 15 , 16 , 17، والتعريب سوبسيلولار بعض الخلايا18،،من1920، إلخ. الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو التدفق الخلوي هو تقنية الكشف عن خلية واحدة يستخدم عادة لقياس بارامترات خلية محددة. متعدد الألوان التدفق الخلوي تدابير عدة علامات على4،3،خلية مفردة21 وهو الأسلوب الأكثر شيوعاً لتحديد النسبة المئوية النسبية لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية، والأرقام بما في ذلك داخل الأورام.
ويصف هذا التقرير إجراءات للتنميط التسلل إلى ورم الخلايا المناعية: 1) غرس أورثوتوبيك بدك الماوس الورم هوموجرافتس، جنبا إلى جنب مع غرس اتفاقية استكهولم؛ 2) ورم الأنسجة الحصاد وإعداد خلية مفردة عبر الورم الانفصال؛ 3) التدفق الخلوي تحليل كافة الخلايا المستمدة من الأورام كخط أساس؛ 4) مقارنة بين الملامح الأساس لكلا النهجين الزرع.
على الرغم من أن أكثر سهولة تجري دراسات باستخدام اتفاقية استكهولم الأورام، نماذج الأورام أورثوتوبيكالي مزروع يحتمل أن يمكن أكثر صلة بدراسات علم الصيدلة السريرية (لا سيما التحقيقات الإدخال/الإخراج) لتقديم المعزز طواعية. يهدف هذا التقرير إلى مساعدة القراء/الجمهور المهتمين ليتمكن من تصور م?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أود أن أشكر الدكتور جودي باربو-لقراءة وتحرير المخطوطة الحرجة، وأشكر مانويل رالف لتصميم الأعمال الفنية. الكتاب أيضا يود أن يشكر فريق علم الأورام في فيفو ، لجهودها التقنية كبيرة وفريق التاج العلوم البيولوجية الأورام الأورام المناعية “العلامات البيولوجية”.
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
knife handle | Jin zhong | J11010 | |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
Studylog software | Studylog | software | |
Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
RNAlater | Thermo | am7021 |