Este artículo describe un método para analizar el contenido de la célula inmune del tejido adiposo por el aislamiento de las células inmunes del tejido adiposo y posterior análisis mediante citometría de flujo.
Infiltración de células inmunes en el tejido adiposo subcutáneo y visceral (a) depósitos conduce a una inflamación de bajo grada que contribuye al desarrollo de complicaciones asociadas a la obesidad como diabetes tipo 2. Cuantitativa y cualitativamente investigar los subconjuntos de células inmunes en humanos en los depósitos, hemos desarrollado un método de citometría de flujo. La fracción vascular estromal (SVF), que contiene las células inmunes, se aísla de la subcutánea y visceral en biopsias por digestión de colagenasa. Adipocitos se eliminan después de la centrifugación. Se tiñen las células SVF para múltiples marcadores de membrana-limite seleccionado para distinguir entre subconjuntos de células inmunitarias y analizaron mediante citometría de flujo. Como resultado de este enfoque, pro – y antiinflamatoria macrófago subconjuntos, las células dendríticas (DCs), células B, CD4+ y CD8+ células T y células NK pueden ser detectadas y cuantificadas. Este método da información detallada sobre las células inmunes en el AT y la cantidad de cada subconjunto específico. Puesto que existen numerosos anticuerpos fluorescentes, nuestro enfoque de citometría de flujo puede ajustarse para medir varios otros marcadores celulares e intracelulares de interés.
Obesidad se caracteriza con en bajo grado inflamación1 y la infiltración de células inmunes inflamatorias en visceral y subcutáneo en (IVA, sAT). Acumulación de células inflamatorias inmunes en el IVA provoca resistencia a la insulina que es el principal factor de riesgo para desarrollar diabetes 2 de tipo2. Las células inmunes del sistema inmune innato y adaptativo se encuentran en la en obesa, como macrófagos, mastocitos, neutrófilos, CD4+ y CD8+ las células T y células B3,4,5,6 ,7. Estas células inmunitarias, junto con las células endoteliales, células estromales, progenitores de adipocitos, fibroblastos y pericitos, constituyen el SVF8 y son la principal fuente de sustancias pro-inflamatorias en el AT9.
El estado inflamatorio de AT es comúnmente investigado por técnicas como Western blot10, qPCR11, inmunohistoquímica11. Sin embargo, al utilizar estas técnicas, en todo, adipocitos y SVF, se utiliza. Esto hace difícil determinar la cantidad y subconjuntos de células inmunes presentes en el AT. Las células inmunes tienen varios marcadores de la célula para definir y categorizar, como los macrófagos. Macrófagos muestran una heterogeneidad significativa en la célula y la función de expresión de marcador superficial12. Por lo tanto, a menudo se dividen en dos poblaciones de macrófagos: M1 y M2. Los macrófagos m2 generalmente se llaman macrófagos alternativamente activados12,13 y residen en el AT de magra, metabólicamente normales seres humanos14. Sin embargo, durante la obesidad, un interruptor fenotípico ocurre de M2 macrófagos macrófagos M1. Clásicamente estos activan M1 macrófagos expresan CD11C12 y se acumulan en adipocitos muertos para formar la corona-como las estructuras13. Se ha demostrado que CD11C+ los macrófagos en la en impedir la acción de la insulina y se asocian a resistencia a la insulina en seres humanos obesos15. Para identificar los macrófagos M1 y M2 en el AT, la inmunohistoquímica es una opción. Esta técnica da información sobre la ubicación de los macrófagos en el tejido. Sin embargo, limitará el número de marcadores que pueden utilizarse en una coloración. Por otra parte, también es difícil de cuantificar. Por lo tanto, para investigar los subconjuntos diferentes de células inmunitarias en el IVA y el sAT depósitos, hemos desarrollado un método de citometría de flujo. Este enfoque nos da la oportunidad de utilizar varios marcadores por celular con citometría de un flujo análisis para definir subconjuntos de la célula y los números de cada subconjunto presente en los depósitos en la cuenta.
Estos métodos describen cómo aislar el SVF de IVA y se sentaban y cuantificar las cantidades relativas de las células inmunes dentro de estos tejidos. Además, los métodos indican cómo determinar la expresión de marcadores en tipos celulares específicos.
Citometría de flujo de las células inmunes del tejido es una técnica poderosa para fenotipo el estado inmunológico de los tejidos. La cuantificación de las células inmunes del tejido puede tener muchas aplicaciones. Como se describe en los resultados, es posible comparar la presencia de células inmunes específicas entre grupos de pacientes (por ejemplo, lean vs obesos). Además, realizando también citometría de flujo en la sangre de los mismos pacientes, se pueden investigar las asociaciones entre la circulación de las células y las células del tejido. Con esta aplicación hemos podido determinar que un subconjunto específico de los monocitos circulantes se asocia con pro-inflamatoria CD11C+ de los macrófagos del tejido adiposo16.
Ajustes en el protocolo descrito ampliará sus aplicaciones como numerosos anticuerpos fluorescentes disponibles citometría de flujo muy versátil. Con los diferentes anticuerpos se distinguen casi todos los tipos de la célula y puede detectarse la expresión de muchos marcadores. Además, es posible manchar marcadores intracelularmente por permeabilizing de la membrana celular para permitir la Unión intracelular de los anticuerpos fluorescentes. Estas características permiten la distinción de las poblaciones de macrófagos muy diversos más allá de los subtipos de macrófagos M1 y M2 excesivamente simplificadas. Además de medida de la expresión superficial del marcador, proteínas (es decir, citoquinas) pueden tinción intracelular facilitando información sobre funcionalidad del macrófago. Además, marcadores de proliferación como el Ki67 se utilizan para cuantificar las tasas de proliferación. Como se describe, distinción entre macrófagos y DCs se basó en niveles MFI de marcadores de DC. Un marcador de macrófagos general, tales como CD68 puede ser incorporado en el panel de macrófagos (FACS panel 1). Sin embargo, CD68 necesita teñirse intracelular que requiere permeabilización de la membrana celular que no es preferible y extendería el protocolo. Otros marcadores de macrófagos son marcadores de subconjunto como CD163 y CD206 o CD11c, este último integrado en el panel de macrófago presentado aquí.
En nuestros paneles de FACS, un marcador para distinguir las células vivas y muertas no se incluyó, que sería preferible porque permite una exclusión más precisa de las células muertas que el uso de FSC y SSC. Utilizadas es el ADN de tinción viabilidad tintes yoduro de propidio (PI) o 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) así como amina libre reaccionar tintes como el LIVE/DEAD fijable muerto celular Kit Stain, que está disponible en colorante diferentes colores. Sin embargo, DAPI y PI no pueden utilizarse cuando se fijan las células. Como se describe en el protocolo, la tinción de viabilidad LIVE/DEAD fijable muerto eritrocitos puede integrarse en dos paneles sin afectar el FACS general Estrategia que bloquean.
Además, los datos se expresan como un porcentaje de células vivas, lo que significa que todos los datos son relativos. Sólo introduciendo un exacto, conocido el número de células en el citómetro de flujo, sería posible determinar las cifras exactas de cada tipo de célula. Un número aproximado de células podría calcularse después de contar las células en la fracción SVF utilizando una cámara de conteo. Sin embargo, este número tendría que ser ajustado por la cantidad de tejido de biopsia utilizado para aislar el SVF, pero esto tiene limitaciones cuando se comparan lean a obesos en. Una masa similar de obesos en consiste en menos adipocitos ya que están llenas de lípidos y han ampliado grandemente. Esto podría conducir a una subestimación del número de células inmunes si presentado como número de células inmunes por gramo de a o por el adipocito.
En estudios en humanos, inclusión de pacientes se realiza durante un largo periodo de tiempo que la estandarización de los procedimientos experimentales de gran importancia. Para la comparación de datos de citometría de flujo entre los pacientes, hay varias opciones. Como se describe en este protocolo, las células pueden fijarse antes de medición permite el análisis de varias muestras en el mismo día. Esto puede lograrse también congelando el SVF antes les coloración, permite que el procedimiento de tinción sea igual entre todas las muestras, pero podría afectar la viabilidad de las células. Por último, también empleado en este estudio, son perlas fluorescentes para instalar los niveles de compensación y citómetro seguimiento granos fueron utilizados dos veces por semana para estandarizar mediciones diarias de la citometría. Esta última opción es la más eficiente cuando mide muestras de un estudio que abarca un largo período de tiempo.
Un factor limitante para citometría de flujo en general es el uso de la fluorescencia. El número de etiquetas fluorescentes que pueden detectarse simultáneamente es limitado debido a la superposición de espectros de emisión. Sin embargo, con smart FACS panel desarrollo y el uso de varios cócteles de anticuerpo por IVA o muestra sAT, este problema puede superarse como se describe en este protocolo. Un aspecto importante del desarrollo del panel de FACS es controles FMO. Mediante el uso de los anticuerpos del grupo excepto uno, potenciales niveles de Autofluorescencia pueden apreciarse al comparar el FMO con el panel completo. Esto permite control exacto de las poblaciones y estos procedimientos deben ser realizados cuando se configura un nuevo panel de FACS. Además, las nuevas generaciones de dispositivos FACS pueden detectar hasta 50 parámetros que permiten la detección simultánea de muchas características por la célula. Otro tema relacionado con el aspecto de la fluorescencia es la autofluorescencia de las células, especialmente macrófagos. Después de la excitación de las células con el láser de FACS (principalmente con 488 excitación de longitud de onda nm), estas células emiten una señal fluorescente (principalmente < 640 nm) que puede traslapo con los espectros de emisión del anticuerpo etiquetas17,18. Para tener en cuenta esto, las células sin manchas deben medirse para determinar la autofluorescencia en cada canal. Con este conocimiento, se deben seleccionar fluorocromos que muestran una señal que excede la señal autofluorescent. Esta señal de fondo autofluorescent debe tenerse en cuenta al determinar la estrategia bloquea de las poblaciones. Por lo tanto, por aplicación de este protocolo y diseño de panel de FACS inteligente es posible en subtipos de profundidad fenotipo macrófago. EN distintos nuevos macrófagos y su función pueden ser caracterizados.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a J. van de Gaar y Vroomen M. (Universidad de Maastricht, los Países Bajos) por su apoyo técnico. Además, nos gustaría dar las gracias K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, y E. Blaak para proporcionar las biopsias de tejido y sangre se utiliza para configurar este protocolo y los experimentos subsecuentes.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |