מאמר זה מתאר שיטה לניתוח תוכן תא החיסון של רקמת שומן על ידי בידוד של תאים חיסוניים של רקמת שומן וניתוח עוקבות באמצעות cytometry זרימה.
חדירה של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן תת עורית, מהבטן (ב) הפקדות מוביל דלקת בדרגה נמוכה תורמים להתפתחות סיבוכים הקשורים להשמנה כגון סוכרת מסוג 2. לחקור באופן כמותי ובאופיו תת-קבוצות תא החיסון-אנוש-פיקדונות, פיתחנו בגישה cytometry זרימה. סטרומה וסקולרית השבר (SVF), המכיל תאים חיסוניים, מופרד מן תת עורית מהבטן-ביופסיות על ידי collagenase עיכול. Adipocytes מוסרים לאחר צנטריפוגה. התאים SVF מוכתמים עבור מספר סמני ממברנה מכורך שנבחרו כדי להבדיל בין קבוצות משנה של תאים חיסוניים, נותחה באמצעות cytometry זרימה. בעקבות גישה זו, pro – ו אנטי – inflammatory מקרופאג קבוצות משנה, תאים דנדריטים (Dc), תאי-B, CD4+ ו CD8+ תאי-T, ואת תאי NK ועוזרת לכמת. שיטה זו מעניקה מידע מפורט אודות תאים חיסוניים ב- AT ואת מידת משנה ספציפי. מאז יש נוגדנים פלורסנט רבים זמינים, בהתקרבות cytometry זרימה יכול להיות מותאם כדי למדוד את סמני הסלולר, תאיים שונים של עניין.
השמנת יתר מאופיין עם AT בדרגה נמוכה דלקת1 וחדירה של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים הקרביים והן תת עורית-(מע”מ, ישב). הצטברות של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים ב במע מ מוביל עמידות לאינסולין הוא גורם הסיכון העיקרי לפיתוח סוג 2 סוכרת2. תאי המערכת החיסונית של שני מולדת, מסתגלת המערכת החיסונית מצויים AT מהשמנת יתר, כגון מקרופאגים, תאי פיטום, נויטרופילים, CD4+ ו CD8+ תאי-T ו B-תאים3,4,5,6 ,7. אלו תאים חיסוניים, יחד עם תאי אנדותל, סטרומה תאים, adipocyte אבות, fibroblasts ו pericytes, מהווים את SVF8 , המקור העיקרי של חומרים פרו-דלקתיים ב AT9.
מצב דלקתי של AT נפוץ נחקר על ידי טכניקות כולל תספיג10, qPCR11אימונוהיסטוכימיה11. עם זאת, בעת שימוש הטכניקות הללו, AT כולו, adipocytes ו SVF, משמש. דבר זה הופך קשה לקבוע את הכמות ואת קבוצות משנה של תאים חיסוניים נוכח AT. תאים חיסוניים יש סמנים שונים תא כדי להגדיר ולסווג אותם, כגון מקרופאגים. מקרופאגים הצג הטרוגניות משמעותי הפונקציה והן תא השטח סמן ביטוי12. לכן, לעתים קרובות הם מסווגים לתוך שתי האוכלוסיות מקרופאג: M1 ו- M2. M2 macrophages נקראים בדרך כלל מופעל לחלופין מקרופאגים12,13 , שוכנים AT של בני אדם רזה, סמויה רגילה14. עם זאת, במהלך השמנה, מתג פנוטיפי למועצה של מקרופאגים M2 M1 מקרופאגים. אלה מופעלות בסגנון קלאסי M1 מקרופאגים אקספרס CD11C12 ולצבור סביב adipocytes מת כדי ליצור מבנים דמויי-כתר13. הוכח כי CD11C+ מקרופאגים ב- AT לפגום אינסולין פעולה והן משויכות תנגודת לאינסולין שמנים בני15. כדי לזהות מקרופאגים M1 ו- M2 ב- AT, אימונוהיסטוכימיה הוא אופציה. טכניקה זו מעניקה מידע על מיקום המקרופאגים ברקמה. עם זאת, תגביל את מספר סמנים יכולים לשמש מכתים אחד. יתר על כן, זה גם קשה לכמת. לכן, כדי לחקור את קבוצות משנה של תאים חיסוניים שונים מע מ ו הלווייני מרבצי, פיתחנו בגישה cytometry זרימה. גישה זו נותן לנו את ההזדמנות להשתמש מספר סמני בכל תא עם ניתוח cytometry זרימה אחת להגדיר קבוצות משנה תא ולספור את המספרים של כל משנה נוכח ההפקדות AT.
שיטות אלה מתארים כיצד לבודד את SVF ממיכל ישב, לכמת את כמויות יחסיות של תאים חיסוניים בתוך רקמות אלו. יתר על כן, השיטות המדינה כיצד לקבוע את הביטוי של סמנים על סוגי תאים ספציפיים.
Cytometry זרימה של רקמת תאים חיסוניים היא טכניקה חזקה כדי ותפקיד המדינה אימונולוגי של רקמות. כימות של רקמת תאים חיסוניים יכולים להיות יישומים רבים. כפי שמתואר את התוצאות, זה אפשרי להשוות בין הנוכחות של תאים חיסוניים מסוימת בין קבוצות של חולים (למשל, רזה לעומת שמנים). בנוסף, על-ידי ביצוע גם cytometry זרימה בדם של החולים באותו, השיוכים בין מחזורי תאים ותאים רקמות יכול ייחקרו. עם יישום זה הצלחנו לקבוע כי קבוצת משנה מסוימת של מחזורי ומונוציטים קשורה הפרו דלקתיים CD11C+ רקמת שומן מקרופאגים16.
התאמות הפרוטוקול המתואר ירחיב וביישומיה כמו רבים זמינים נוגדנים פלורסנט להפוך cytometry זרימה מאוד תכליתי. עם נוגדנים שונים ניתן להבחין כמעט כל סוגי תאים, הביטוי של סמנים רבים יכולים להתגלות. יתר על כן, זה אפשרי כתם סמנים intracellularly על ידי permeabilizing את קרום התא כדי לאפשר מחייב תאיים של הנוגדנים פלורסנט. מאפיינים אלה מאפשרים הבחנה של אוכלוסיות מקרופאג מגוונת מאוד מעבר סוגי מקרופאג פשוט יותר מדי המשנה M1 ו- M2. מלבד מדידה של השטח סמן ביטוי, חלבונים (קרי, ציטוקינים) יכול להיות מוכתם intracellularly המספקים מידע על מקרופאג פונקציונליות. בנוסף, התפשטות סמנים כגון Ki67 משמשים כדי לכמת את התפשטות המחירים. כפי שתואר, ההבחנה בין מקרופאגים בקרי קבוצת מחשבים התבססה על MFI רמות של סמנים DC. סמן מקרופאג כלליות, כגון CD68 ניתן לשלב לתוך לוח מקרופאג (FACS לוח 1). עם זאת, CD68 צריך להיות מוכתם permeabilization intracellularly דרישה של קרום התא אשר לא עדיפה, להאריך את הפרוטוקול. סמנים אחרים מקרופאג הם סמנים משנה כגון CD163, CD206 או CD11c, האחרון להיות משולב בלוח מקרופאג המוצג כאן.
פאנלים FACS שלנו, לא היה סמן כדי להבחין בין תאים מתים וחיים כלולים, וזה יהיה עדיף, משום שהיא מאפשרת הדרה מדויקת יותר של תאים מתים מאשר השימוש FSC האס. שימוש תכוף הם ה-DNA מכתים הכדאיות צבעי propidium יודיד (PI) או 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) וכן אמין חינם מגיבה צבעי כגון חי/מת שניתן לתקן מת תא כתם הערכה, אשר זמינה בצבעים שונים לצבוע. עם זאת, PI, דאפי לא ניתן להשתמש בעת תיקון התאים. כמפורט בפרוטוקול, ההכתמה הכדאיות תא מת שניתן לתקן חי/מת אדום ניתן לשלב שני לוחות מבלי להשפיע על FACS הכוללת gating אסטרטגיה.
בנוסף, הנתונים מבוטאים כאחוזים של תאים חיים, כלומר שכל הנתונים הם יחסיים. רק על-ידי הזנת המדויק, ידוע מספר תאים לתוך cytometer הזרימה, האם זה אפשרי לקבוע את המספרים המדויקים של כל סוג התא. מספר משוער של תאים יכול לחשב לאחר ספירת התאים השבר SVF באמצעות חדר הספירה. עם זאת, מספר זה חייב להיות מותאם עבור כמות הרקמה ביופסיה נהגו לבודד את SVF, אבל יש מגבלות בהשוואת רזה כדי שמנים. מסה דומה של AT שמנים מורכבת פחות adipocytes כפי שהם מלאים ליפידים הורחב באופן משמעותי. זה יכול להוביל underestimation של מספר תאים חיסוניים אם הציג מספר של תאים חיסוניים לגרם של או לפי adipocyte.
מחקרים בבני אדם, הכללה של חולים נעשית בדרך כלל לאורך תקופה ארוכה יותר של זמן לעשות סטנדרטיזציה של נהלים ניסיוני חשיבות רבה. לשם השוואה של נתונים cytometry זרימה בין המטופלים, קיימות מספר אפשרויות. כפי שמתואר פרוטוקול זה, ניתן לתקן תאים לפני המדידה המאפשר ניתוח של מספר דגימות באותו יום. זה יכול להיעשות גם על ידי הקפאת את SVF לפני מכתימה אותם, מה שמאפשר ההליך מכתימים כשווה בין כל דוגמאות, אך עלולים להיות מושפעים הכדאיות של תאים. לבסוף, מועסק גם במחקר זה, הן חרוזים פלורסנט להתקין רמות הפיצוי, cytometer מעקב חרוזים שימשו דו-שבועי לתקנן את המידות היומי של cytometer. אפשרות אחרונה זו היא היעילה ביותר כאשר מדידת דגימות מחקר המתפרסות על-פני תקופה ארוכה של זמן.
גורם מגביל עבור cytometry זרימה באופן כללי הוא השימוש של זריחה. מספר התוויות פלורסנט שניתן לאתר בו זמנית הוא מוגבל בשל חפיפה ב ספקטרום הפליטה. עם זאת, עם פיתוח לוח FACS חכם, השימוש קוקטיילים מספר נוגדנים לכל מע מ או לטעום הלוויני, בעיה זו ניתן להתגבר כפי שמתואר פרוטוקול זה. היבט חשוב של פיתוח לוח FACS היא שולטת FMO. באמצעות לכל הנוגדנים של הפאנל חוץ מאחד, רמות autofluorescence פוטנציאליים ניתן להערכה כאשר משווים את FMO עם הפאנל מלאה. דבר זה מאפשר gating מדויק של אוכלוסיות, הליכים אלה יש לבצע בעת הגדרת פאנל FACS חדש. בנוסף, הדור החדש של התקנים FACS יכול לזהות פרמטרים עד 50 המאפשר זיהוי סימולטני של מאפיינים רבים בכל תא. בעיה נוספת הקשורה ההיבט פלורסצנטיות היא autofluorescence של תאים, בעיקר מקרופאגים. לאחר עירור של התאים עם לייזר FACS (בעיקר עם 488 ננומטר אורך גל עירור), תאים אלה פולטים אותות פלואורסצנט (בעיקר < 640 ננומטר) אותם ניתן חפיפה עם ספקטרום פליטה של הנוגדן מתייג17,18. כדי להסביר זאת, יש למדוד תאים וללא רבב כדי לקבוע את autofluorescence בכל אחד מהערוצים. עם הידע הזה, fluorochromes כדאי שנבחר להציג חוזק האות שחורג האות autofluorescent. . האות רקע autofluorescent הזה צריך להילקח בחשבון בקביעת האסטרטגיה חסימה של האוכלוסיות. לכן, על-ידי יישום של פרוטוקול זה תכנון תבוני של החלונית FACS אפשרי בעומק פנוטיפ מקרופאג יחוברו. AT ברורים חדשים מקרופאגים והתפקוד שלהם ניתן לאפיין.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות ג’יי ואן דה Gaar Vroomen מ’ (אוניברסיטת מאסטריכט, הולנד) לתמיכה טכנית שלהם. בנוסף, ברצוננו להודות ק’ Verboven, ד הנסן, ג’יי Jocken, ומשמשת Blaak אי מתן דם ורקמות והביופסיות עבור הגדרת פרוטוקול זה ואת הניסויים הבאים.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |