Este artigo descreve um método para analisar o conteúdo da célula imune do tecido adiposo por isolamento de células do sistema imunológico de tecido adiposo e posterior análise utilizando a citometria de fluxo.
Infiltração de células do sistema imunológico no tecido adiposo subcutâneo e visceral (AT) depósitos leva a uma inflamação de baixo grau contribuindo para o desenvolvimento de complicações associadas a obesidade como a diabetes tipo 2. Para quantitativamente e qualitativamente investigar os subconjuntos de célula imunológica em humanos em depósitos, desenvolvemos uma abordagem de citometria de fluxo. A fração do estroma vascular (SVF), que contém as células do sistema imunológico, é isolada da subcutânea e visceral em biópsias por digestão de colagenase. Adipócitos são removidos após a centrifugação. As células SVF estão manchadas por vários marcadores de membrana-limite selecionado para diferenciar entre os subconjuntos de células imunes e analisados utilizando citometria de fluxo. Como resultado desta abordagem, pro e anti angentes macrófago subconjuntos, células dendríticas (DCs), células B, CD4+ e CD8+ -células T, células NK podem ser detectadas e quantificadas. Este método fornece informações detalhadas sobre as células imunes no AT e a quantidade de cada subconjunto específico. Uma vez que existem inúmeros anticorpos fluorescentes disponível, nossa abordagem de citometria de fluxo pode ser ajustada para medir vários outros marcadores celulares e intracelulares de interesse.
A obesidade é caracterizada com baixa qualidade AT inflamação1 e infiltração de células imunes pró-inflamatórias em visceral e subcutânea em (IVA, sentou-se). Acúmulo de células imunes pro-inflamatórios no caldeirão leva à resistência à insulina, que é um fator de risco principal para desenvolver o tipo 2 diabetes2. Células do sistema imunológico do sistema imune inato e adaptativo são encontradas no AT obeso, tais como os mastócitos, macrófagos, neutrófilos, CD4+ e CD8+ células T e células B3,4,5,6 ,7. Estas células do sistema imunológico, juntamente com as células endoteliais, células do estroma, progenitores dos adipócitos, fibroblastos e pericitos, constituem o SVF8 e são a principal fonte de substâncias pró-inflamatórias do AT9.
O status inflamatório da AT é comumente investigado por técnicas incluindo borrão ocidental10qPCR11e imuno-histoquímica11. No entanto, ao usar essas técnicas, o AT todo, adipócitos e SVF, é usado. Isso torna difícil determinar a quantidade e subconjuntos de células do sistema imunológico presentes no AT. As células imunes têm vários marcadores de célula para definir e categorizá-los, tais como os macrófagos. Os macrófagos mostram heterogeneidade significativa em tanto a função e a célula de expressão do marcador de superfície12. Portanto, eles frequentemente são categorizados em duas populações de macrófagos: M1 e M2. Os macrófagos m2 são geralmente chamados de macrófagos alternativamente ativados12,13 e residem no AT do seres humanos metabolicamente normais, magra14. No entanto, durante a obesidade, um interruptor fenotípico ocorre de macrófagos M2 aos macrófagos M1. Estas classicamente ativado M1 macrófagos expressam CD11C12 e se acumulam em torno de adipócitos mortos para formar estruturas semelhantes a coroa13. Tem sido demonstrado que CD11C+ macrófagos no AT prejudicar a ação da insulina e estão associados com a resistência à insulina em humanos obesos15. Para identificar os macrófagos M1 e M2 no AT, imuno-histoquímica é uma opção. Esta técnica dá informações sobre a localização dos macrófagos no tecido. No entanto, que vai limitar o número de marcadores que podem ser usados em uma coloração. Além disso, também é difícil de quantificar. Portanto, para investigar os subconjuntos de células imunes diferentes no IVA e depósitos via satélite, nós desenvolvemos uma abordagem de citometria de fluxo. Esta abordagem dá-na oportunidade de usar vários marcadores por célula com análise de citometria de um fluxo definir subconjuntos de célula e contar os números de cada subconjunto presente nos depósitos de AT.
Esses métodos descrevem como isolar o SVF do IVA e sentou-se e quantificar os montantes relativos de células imunes dentro desses tecidos. Além disso, os métodos do estado como determinar a expressão de marcadores em tipos específicos de célula.
Citometria de fluxo das células do sistema imunológico de tecido é uma técnica poderosa para fenótipo o estado imunológico dos tecidos. A quantificação de células do sistema imunológico de tecido pode ter muitas aplicações. Conforme descrito nos resultados, é possível comparar a presença de células do sistema imunológico específicas entre grupos de pacientes (por exemplo, magra vs obesos). Além disso, também realizando citometria de fluxo no sangue dos pacientes mesmos, associações entre células de tecidos e células de circulação podem ser investigadas. Com esta aplicação fomos capazes de determinar que um subconjunto específico de monócitos em circulação é associado com pro-inflamatórios CD11C+ de macrófagos de tecido adiposo16.
Ajustes do protocolo descrito expandirá suas aplicações como numerosos disponíveis anticorpos fluorescentes fazem citometria de fluxo muito versátil. Com diferentes anticorpos podem distinguir-se quase todos os tipos de células e a expressão de muitos marcadores pode ser detectada. Além disso, é possível ficar manchado marcadores intracelular por permeabilizing da membrana celular para permitir a ligação intracelular dos anticorpos fluorescentes. Estas características permitem a distinção das populações muito diversas macrófago além os subtipos de macrófagos M1 e M2 excessivamente simplificadas. Além de medição da expressão do marcador de superfície, proteínas (ou seja, citocinas) podem ser manchadas intracelular, fornecendo informações sobre a funcionalidade de macrófagos. Além disso, os marcadores de proliferação como Ki67 são usados para quantificar taxas de proliferação. Conforme descrito, distinção entre macrófagos e DCs foi baseada em níveis de IFM de marcadores de DC. Um marcador para macrófagos geral, tais como CD68 pode ser incorporado do painel do macrófago (FACS painel 1). No entanto, CD68 precisa ser manchado intracelular que requerem permeabilização da membrana celular que não é preferível e seria estender o protocolo. Outros marcadores de macrófagos são marcadores de subconjunto como CD163 e CD206 ou CD11c, sendo este último integrado no painel do macrófago aqui apresentado.
Em nossos painéis de FACS, um marcador para distinguir células vivas e mortas não foi incluído, que seria preferível, porque permite uma exclusão mais precisa de células mortas do que o uso do FSC e SSC. Frequentemente usados é o DNA coloração viabilidade corantes iodeto de propidium (PI) ou 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bem como amina livre reagindo corantes como o LIVE/mortos fixável mortos célula mancha Kit, que está disponível em cores diferentes de tinta. No entanto, PI e DAPI não podem ser usado quando as células de fixação. Conforme descrito no protocolo, a coloração de viabilidade fixável LIVE/DEAD Red Cell morta pode ser integrada em ambos os painéis sem afetar o geral FACS gating estratégia.
Além disso, os dados são expressos como uma porcentagem de células vivas, ou seja, todos os dados são relativos. Apenas inserindo um exato, conhecido o número de células para o citômetro de fluxo, será possível determinar os números exatos de cada tipo de célula. Um número aproximado de células poderia ser calculado após a contagem das células na fração SVF usando uma câmara de contagem. No entanto, esse número teria que ser ajustado para a quantidade de tecido de biópsia usado para isolar o SVF, mas isso tem limitações quando comparando magra para obesos em. Uma massa semelhante de obeso AT consiste menos adipócitos, como eles são preenchidos com lipídios e expandiram-se grandemente. Isto poderia levar a uma subestimação do número de células imunes se apresentado como o número de células do sistema imunológico por grama de no ou por adipócitos.
Em estudos humanos, a inclusão de pacientes é feito geralmente por um longo período de tempo, tornando a padronização de procedimentos experimentais de grande importância. Para comparação dos dados de citometria de fluxo entre pacientes, existem várias opções. Conforme descrito no presente protocolo, as células podem fixar-se antes da medição, permitindo a análise de várias amostras no mesmo dia. Isto também pode ser conseguido congelando o SVF antes mancha-los, que permite que o procedimento de coloração ser igual entre todas as amostras, mas a viabilidade das células pode ser afetada. Por último, também utilizados neste estudo, são grânulos fluorescentes para instalar os níveis de compensação, e grânulos de rastreamento citômetro foram usados bi-semanal para padronizar as medições diárias do citômetro. Esta última opção é mais eficiente quando medir amostras de um estudo abrangendo um longo período de tempo.
Um fator limitante para citometria de fluxo em geral é o uso da fluorescência. O número de etiquetas fluorescentes que podem ser detectados simultaneamente é limitado devido à sobreposição em espectros de emissão. No entanto, com desenvolvimento de painel inteligente FACS e o uso de vários cocktails de anticorpo por IVA ou amostra sAT, esse problema pode ser superado, conforme descrito no presente protocolo. Um aspecto importante do desenvolvimento de painel de FACS é FMO controles. Usando todos os anticorpos do painel, com exceção de uma, níveis possíveis de autofluorescência podem ser apreciados quando se compara o FMO com o painel completo. Isto permite gating precisos das populações e esses procedimentos devem ser realizados quando a criação de um novo painel de FACS. Além disso, as novas gerações de dispositivos de FACS podem detectar até 50 parâmetros que permite a deteção simultânea de muitas características por célula. Outra questão relacionada com o aspecto de fluorescência é a autofluorescência de células, especialmente de macrófagos. Após a excitação das células com o laser de FACS (principalmente com a excitação de comprimento de onda 488 nm), estas células emitem um sinal fluorescente (principalmente < 640 nm) que pode coincidir com os espectros de emissão do anticorpo rotula17,18. Para explicar isso, imaculadas células devem ser medidas para determinar a autofluorescência em cada canal. Com esse conhecimento, fluorochromes devem ser selecionados que exibem um sinal que excede o sinal de autofluorescent. Este sinal de fundo de autofluorescent deve ter em conta ao determinar a estratégia associada das populações. Portanto, pela aplicação do presente protocolo e design de painel de FACS inteligente é possível em subtipos de macrófagos de fenótipo de profundidade. Nova AT distinta macrófagos e sua função podem ser caracterizados.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a J. van de Gaar e M. Vroomen (Universidade de Maastricht, Países Baixos), pelo apoio técnico. Além disso, gostaríamos de agradecer a K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, e E. Blaak para fornecer as biópsias de sangue e tecido usado para a configuração deste protocolo e as experiências subsequentes.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |