Cet article décrit une méthode pour analyser le contenu de la cellule immunitaire du tissu adipeux par l’isolement de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et l’analyse ultérieure à l’aide de cytométrie en flux.
Infiltration de cellules immunitaires dans le tissu adipeux sous-cutané et viscéral (AT) dépôts conduit à une inflammation de bas grade qui contribuent à l’apparition de complications associées à l’obésité comme le diabète de type 2. Pour quantitativement et qualitativement, étudier les sous-ensembles de cellules immunitaires chez l’homme à des dépôts, nous avons développé une approche de cytométrie de flux. La fraction stroma vasculaire (SVF), contenant les cellules immunitaires, est isolée de sous-cutané et viscéral à biopsies par digestion de collagénase. Les adipocytes sont supprimés après centrifugation. Les cellules SVF sont colorées pour plusieurs marqueurs membranaires choisie pour différencier les sous-ensembles de cellules immunitaires et analysés par cytométrie en flux. Grâce à cette approche, pro – et anti-inflammatoires, sous-ensembles macrophages, cellules dendritiques (CD), les lymphocytes B, les CD4+ et CD8+ T-cellules, et les cellules NK peuvent être détectés et quantifiées. Cette méthode donne des informations détaillées sur les cellules immunitaires en AT et le montant de chaque sous-ensemble spécifique. Puisqu’il y a de nombreux anticorps fluorescents disponibles, notre approche de cytométrie de flux peut être ajusté pour mesurer divers autres marqueurs cellulaires et intracellulaires d’intérêt.
L’obésité est caractérisée par de bas grade AT inflammation1 et l’infiltration de cellules immunitaires pro-inflammatoires en sous-cutané et viscéral à (TVA, samedi). L’accumulation de cellules immunitaires pro-inflammatoires dans la cuve mène à l’insulinorésistance qui est le principal facteur de risque pour développer le type 2 diabète2. Les cellules immunitaires du système immunitaire inné et adaptatif sont trouvent en l’obésité, tels que les macrophages, les mastocytes, les polynucléaires neutrophiles, CD4+ et CD8+ T-cellules et cellules B3,4,5,6 ,,7. Ces cellules immunitaires, ainsi que les cellules endothéliales, les cellules du stroma, progéniteurs adipocytaires, fibroblastes et péricytes, constituent le SVF8 et sont la principale source de substances pro-inflammatoires dans les AT9.
L’état inflammatoire de la TA est couramment étudiée par techniques dont la tache occidentale10, qPCR11et immunohistochimie11. Toutefois, lorsque vous utilisez ces techniques, l’ensemble AT, adipocytes et SVF, est utilisé. Cela rend difficile de déterminer le montant et les sous-ensembles de cellules immunitaires présentes dans l’AT. Les cellules immunitaires ont divers marqueurs de cellule à définir et à classer, tels que les macrophages. Macrophages montrent une hétérogénéité significative dans les deux fonctions et cellule marqueur de surface expression12. Donc, ils sont souvent classés en deux populations de macrophage : M1 et M2. M2 macrophages sont généralement appelés macrophages activés par ailleurs12,13 et résident en l’homme maigre, métaboliquement normaux14. Toutefois, au cours de l’obésité, un switch phénotypique se produit de macrophages M2 aux macrophages M1. Classiquement, ces activé M1 macrophages expriment CD11C12 et s’accumulent autour des adipocytes morts pour former des structures ressemblant à couronne13. Il a été démontré que CD11C+ macrophages en l’entraver l’action de l’insuline et sont associés à la résistance à l’insuline dans les humains obèses15. Pour identifier les macrophages M1 et M2 dans l’AT, l’immunohistochimie est une option. Cette technique donne des informations sur l’emplacement des macrophages dans les tissus. Cependant, il limitera le nombre de marqueurs qui peuvent être utilisés dans une coloration. En outre, il est également difficile à quantifier. Par conséquent, afin d’étudier les sous-ensembles de différentes cellules immunitaires dans les cuves et dépôts sAT, nous avons développé une approche de cytométrie de flux. Cette approche nous donne la possibilité d’utiliser des marqueurs multiples par cellule avec analyse en cytométrie en un flux à définir des sous-ensembles de cellules et de compter le nombre de chaque sous-ensemble présent dans les dépôts AT.
Ces méthodes décrivent comment isoler le SVF de TVA et assis et quantifier les quantités relatives des cellules immunitaires dans ces tissus. En outre, les méthodes indiquent comment déterminer l’expression de marqueurs sur les types spécifiques de cellules.
Cytométrie en flux des cellules immunitaires de tissus est une technique puissante pour phénotype l’État immunologique des tissus. La quantification des cellules immunitaires tissulaires peut avoir de nombreuses applications. Comme décrit dans les résultats, il est possible de comparer la présence de cellules immunitaires spécifiques entre les groupes de patients (p. ex., maigre ou obèse). En outre, en effectuant aussi cytométrie en flux sur le sang des patients mêmes, les associations entre cellules circulantes et les cellules des tissus peuvent être étudiées. Avec cette application, nous avons pu déterminer qu’un sous-ensemble spécifique des monocytes circulants est associé par CD11C pro-inflammatoires+ de macrophages de tissu adipeux16.
Ajustements au protocole décrit accroîtra ses demandes de nombreux anticorps fluorescents disponibles font de cytométrie en flux très polyvalent. Avec différents anticorps se distingués presque tous les types de cellules et l’expression de plusieurs marqueurs peut être détectée. En outre, il est possible de colorer les marqueurs dans les cellules de perméabiliser la membrane cellulaire pour autoriser la liaison intracellulaire des anticorps fluorescents. Ces caractéristiques permettent la distinction des populations très diverses macrophage au-delà les sous-types de macrophage M1 et M2 trop simplifiées. Outre mesure de l’expression du marqueur de surface, les protéines (c.-à-d., cytokines) peuvent être colorés intracellulairement fournissant des informations sur la fonctionnalité de macrophages. En outre, marqueurs de prolifération comme Ki67 servent à quantifier le taux de prolifération. Tel que décrit, distinction entre macrophages et DCs reposait sur les niveaux de l’IFM de marqueurs de DC. Un marqueur de macrophage générales, telles que CD68 peut être incorporé dans le panneau de macrophages (FACS panneau 1). Toutefois, CD68 doit être teinté intracellulairement nécessitant une perméabilisation de la membrane cellulaire qui n’est pas préférable et étendrait le protocole. Autres marqueurs de macrophages sont des marqueurs de sous-ensemble comme CD163 et CD206 ou CD11c, intégré dans le panneau de macrophage présenté ici.
Nos panneaux de FACS, un marqueur pour distinguer les cellules vivantes et mortes n’a pas été inclus, qui serait préférable car elle permet une exclusion plus précise des cellules mortes que l’utilisation du FSC et SSC. Fréquemment utilisés est l’ADN coloration viabilité colorants iodure de propidium (PI) ou 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ainsi que l’amine libre réagissant colorants tels que le LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, qui est disponible en colorant de différentes couleurs. Cependant, PI et DAPI ne peuvent servir pour la fixation des cellules. Comme décrit dans le protocole, la coloration de la viabilité LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell peut être intégrée dans les deux panneaux sans affecter la FACS globale stratégie de blocage.
En outre, les données sont exprimées en pourcentage de cellules vivantes, ce qui signifie que toutes les données sont relatives. Seulement en participant à une exacte, connu nombre de cellules dans le cytomètre en flux, serait-il possible de déterminer le nombre exact de chaque type de cellule. Un nombre approximatif de cellules pourrait être calculé après avoir compté les cellules de la fraction SVF à l’aide d’une chambre de comptage. Toutefois, ce numéro devra être ajustée pour la quantité de tissu biopsie utilisé pour isoler le SVF, mais cela a des limites lorsque l’on compare les maigres d’obèses au. Une masse semblable d’obèse AT consiste moins adipocytes car ils sont remplis de lipides et ont augmenté considérablement. Cela pourrait conduire à une sous-estimation du nombre de cellules immunitaires si présenté comme nombre de cellules immunitaires par gramme d’à ou par les adipocytes.
Dans les études chez l’homme, l’inclusion des patients se faite généralement sur une longue période de temps à faire de la normalisation des procédures expérimentales de grande importance. Pour la comparaison des données de cytométrie de flux entre les patients, il y a plusieurs options. Comme décrit dans le présent protocole, les cellules peuvent être fixés avant la mesure permettant l’analyse de plusieurs échantillons le jour même. Ceci peut être aussi réalisé en gelant le SVF avant leur coloration, qui permet à la procédure de marquage égal entre tous les échantillons, mais la viabilité de cellules peut-être être touchée. Enfin, également employée dans cette étude, sont des perles fluorescentes pour installer des niveaux de rémunération, et cytomètre suivi perles servaient toutes les deux semaines à normaliser les mesures quotidiennes du cytomètre. Cette dernière option est la plus efficace lors de la mesure des échantillons provenant d’une étude s’étendant sur une longue période de temps.
Un facteur limitant pour la cytométrie en flux est en général l’utilisation de la fluorescence. Le nombre d’étiquettes fluorescentes peuvent être mesurées simultanément est limité en raison du chevauchement des spectres d’émission. Cependant, avec développement de panneau de FACS smart et l’utilisation de plusieurs cocktails d’anticorps par TVA ou échantillon sAT, ce problème peut être surmonté comme décrit dans le présent protocole. Un aspect important du développement de panneau de FACS est FMO contrôles. En utilisant les anticorps du panneau sauf un, des niveaux d’autofluorescence potentiels peuvent être appréciés lorsque l’on compare la FMO avec le panneau plein. Cela permet un blocage précis des populations et ces procédures doivent être effectuées lorsque vous configurez un nouveau panneau de FACS. En outre, les nouvelles générations d’appareils FACS peuvent détecter jusqu’à 50 paramètres permettant la détection simultanée de nombreuses caractéristiques par cellule. Une autre question liée à l’aspect de la fluorescence est l’autofluorescence des cellules, notamment les macrophages. Après l’excitation des cellules avec le laser de FACS (principalement avec 488 nm longueur d’onde d’excitation), ces cellules émettent un signal fluorescent (principalement < 640 nm) que peut chevauchement avec les spectres d’émission de l’anticorps étiquettes17,18. Pour expliquer cela, cellules incolores doivent être mesurés afin de déterminer l’autofluorescence dans chaque canal. Sachant cela, il faut choisir fluorochromes qui affichent une puissance du signal qui dépasse le signal auto-fluorescente. Ce signal de fond auto-fluorescente devrait tenir compte lorsqu’il détermine la stratégie de blocage des populations. Donc, par application du présent protocole et de la conception des panneaux intelligente FACS, il est possible d’en sous-types de profondeur phénotype macrophage. Nouveau AT distincte macrophages et leurs fonctions peuvent être caractérisées.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier J. van de RGAÉ et M. Vroomen (Université de Maastricht, Pays-Bas) pour leur soutien technique. En outre, nous tenons à remercier Verboven K., D. Hansen, J. SoFrano, et E. Blaak pour fournir les biopsies de sang et les tissus utilisés pour mettre en place ce protocole et les expériences ultérieures.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |