CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험
Summary
한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.
Abstract
G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.
Introduction
G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리1. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 Gα의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 Gβγ 소 단위. Gα 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (Gα-GTP와 Gβγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로2,3. Gα-GTP 분해 된다 때 다시 협회 Gα의 GDP와 Gβγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태3,4. G 단백질의 다른 종류 (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), 존재는 Gα 소 단위5시퀀스 유사성에 따라 분류 한다. 모두 이러한 G 단백질 수용 체 활성화에 생물학 응답 기초 정의 된 세포내 신호 통로 유도. 수용 체 활성화 후 GPCR kinases (GRKs) 함으로써 β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하는 GPCRs의 세포내 꼬리 phosphorylate. 이 프로세스는 G 단백질 신호, 수용 체 탈 감 작과 국제화6의 종료에 리드. Β-arrestins는7을 신호 하는 G 단백질의 독립적인 폭포 트리거 신호 다 분자 복합물의 부분 있습니다.
GPCRs는 치료 적 개입에 대 한 가장 유효한 분자 표적 사이 많은의 병 인에 기여 하 고 규제 완화 GPCR 중재 신호, 예를 들면 수용 체 유전자 또는 수용 체 overexpression에 이득의 기능 돌연변이 때문으로 인간의 질병8. 따라서, GPCRs 제약 산업8,,910조사 약물 목표의 가장 중요 한 클래스 중 하나를 나타냅니다. 임상 관련 GPCR의 주목할 만한 보기는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11유일한 자연 리간드에 의해 활성화 될 수 있는 이다. 때문에 인간 면역 결핍 바이러스 1에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 (HIV-1) 항목 및 클러스터 차별화 4의 (CD4) 긍정적인 T 세포12, CXCR4 항 바이러스 약물 대상으로 조사에 처음에 감염. 더 골에서 CXCL12 CXCR4 상호 작용 조절 유지 그리고 줄기와 뿌리의 유도 세포13. 또한, 암 생물학 (예: 종양 세포 생존, 전이, 종양 관련 신생)14 의 여러 측면에 몇 가지 다른 인간의 질병 (예를 들어, 염증 성 질환)15, CXCR4의 개입을 주어진 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 상당한 관심을 발생합니다. AMD3100, 특히 표적으로 CXCR4, 작은 분자 항 HIV 약물 후보16 처음 밝혀졌다 이며 여전히 가장 강력한 CXCR4 길 항 근 날짜17에 설명 중 하나. 그러나 개발으로는 항 바이러스 약물은,,18를 중단. 현재이 분자 다 발성 림프 종 환자18의 치료 중 줄기 세포 동원 에이전트로 사용 됩니다. 다른 여러 가지 화학적으로 관련이 없는 작은 분자와 다양 한 효능 가진 CXCR4 기능을 억제 하는 생물 의약품 설명된19되었습니다.
수용 체 바인딩 메서드는 관심의 GPCR와 직접 상호 작용 하는 화합물 (예를 들어, 작은 분자)의 id를 허용 하는 약리학에 귀중 한 도구입니다. 바인딩 연구를 수행 하기 위해서는 세포내 신호 속성 또는 특정된 GPCR의 기능에 관한 사전 지식에 대 한 필요가 있다. 이 이점을로 간주 될 수 있습니다, 하지만 그것은 화합물 바인딩 설명 될 수 있는 수용 체에 대 한 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 평가 하 여 특징 추가 될 필요가 의미. 이 활동은 GPCR 연구에 관련 된 약리학 또는 생물학 분석 실험을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그들의 작업 프로필에 의존, 수용 체 바인딩 분자 수 있습니다 다음 잠재적으로 진화 될 전 임상 및 임상 연구에 조사에 대 한 소설 리드 화합물. 예를 들어 종양 세포20, 비 침 투 적인 vivo에서 이미징 radiolabeling 여 치료 또는 진단 도구를 생성 하는 건설 기계 또는 잠재력으로 특히 높은 선호도와 수용 체에 묶는 분자도 사용할 수 있습니다. 치료제21의 대상 배달 차량. CXCR4, 경우 종양 세포의 이미징 vivo에서 이미 입증 되었습니다 레이블이 CXCR4 타겟팅 분자 인간 암 xenografts20,22,23의 시각화를 허용 하는 어떤 점에서 마우스 모델을 사용 하 여 .
이 보고서에서 우리는 작은 분자와 방해 하는 직접 길 항 제 (CXCL12) 바인딩 CXCR4 biologics의 식별을 가능 하 게 경쟁 바인딩 분석 결과 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 기본 원리는 붙일 레이블된 ligand의 고정 된 금액 간의 경쟁 (CXCL12AF647, 참조 테이블의 재료 및 시 약)과 화합물 바인딩 수용 체 단백질17, 에 대 한 레이블 없음 24. 레이블이 ligand CXCR4 표현 하는 단일 셀에 바인딩된에서 특정 형광 신호 다음 cytometry에 의해 분석 됩니다. 이 형광 신호 레이블 없는 작은 분자 CXCL12AF647 와 CXCR4 간의 상호 작용을 방해 하는 경우에 줄어들 것입니다. 분석 결과 endogenously 익스프레스 CXCR4 조작 아닌 살아있는 세포를 사용 하 여 (즉, Jurkat 세포). 따라서, 아무 세포 막 준비는 필요 하 게 분석 결과 편리, 신속 하 고 늘어난된 처리량과 호환. 붙일 레이블된 ligand 사용 되므로 방사능은 피 한다.
분석 결과에서 CXCL12AF647 바인딩을 방해 하는 작은 분자 화합물 (즉, 바인딩 사이트는 자연에 의해 점령 orthosteric 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용을 확률이 CXCL12 CXCR4 위한 자연 길 항 제 이므로 주 작동 근)입니다. 그들은 CXCL12의 바인딩을 좌우 하지 않는다 것 세 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용 하는 분자 들 키 지 않고, 남아 있습니다. 예를 들어, 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기, 분자 allosteric 바인딩 사이트25에 행동을 타겟팅 하는 GPCR의 중요 하 고 신흥 카테고리 것입니다 잠재적으로 하지 주워이 분석 결과 함께. 또한, 수용 체 길 항 제 또는 촉진제로는 화합물이 바인딩 분석 기능으로 식별 여부를 파생 수 없습니다. 추가적인 약리 또는 기능 수용 체 관련 분석 실험에서 확인 된 화합물의 조사 따라서 하셔야 합니다. 이 분석 실험의 (조합) 포함 될 수 있습니다 두 번째 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (캠프)), phenotypic의 검출에 대 한 분석 실험 세포 형광 또는 발광 기반 또는 생물학 분석 실험 및 β-arrestin GPCR 연구의 특정 신호 속성에 따라 어떤 선택 채용 분석 실험 따라서, 주로 여기에 설명 된 경쟁 바인딩 분석 결과 초기 심사 분석 결과 수용 체 바인딩 힘으로 화합물의 깊이 특성을 사용 하도록 다른 세포 기반 분석으로 보완 하는 역할을 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 에릭 Fonteyn 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08)와 Fondation Dormeur 파두츠.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
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