蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定
Summary
フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。
Abstract
G タンパク質共役受容体 (Gpcr) の薬理学的対象は、人間の健康に非常に重要な多くの病気の進行に貢献する機能不全 GPCR を介したシグナル伝達します。リガンド ・受容体ペア CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)/CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) がんや炎症性疾患の治療のための潜在的なターゲットとして、例えば重要な臨床的関心を調達しています。特に CXCR4 をターゲットし、受容体の機能を阻害する抗体と同様、小分子と見なされる薬理学的に貴重なツールをします。ここでは、フロー フローサイトメトリーを用いた細胞試金 CXCR4 に cxcl 12 バインディングを破棄する化合物 (例えば、小分子) の同定を可能にするを説明します。基本的には、アッセイは、受容体 CXCR4 の自然ケモカイン アゴニスト蛍光に分類された cxcl 12 の固定量とラベルのない化合物の結合のための競争に依存します。したがって、このアッセイで放射能によって分類されたプローブの望ましくない使用は避けます。さらに、生きている細胞は、細胞膜の準備ではなく受容体 (CXCR4) のソースとして使用されます。これによりスループットが向上版のフォーマットにアッセイの容易に適応できます。この試金は CXCR4 ターゲット化合物を識別するために貴重なジェネリック医薬品検出アッセイする示されています。プロトコル可能性がありますに対応できる他の Gpcr 少なくとも蛍光リガンドは利用または生成することができるかどうか。これらの Gpcr の活性化により誘導される細胞内シグナル伝達経路に関する事前の知識は必要ありません。
Introduction
G タンパク質共役受容体 (Gpcr) はセル表面蛋白質 (例えばペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン) 細胞外リガンドによって活性化することができます、1を処理により多くの生理学的発達を調節します。受容体蛋白質の誘起構造変化が細胞内受容体関連ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαから成る結合を促進するアゴニストは、GPCR 結合ポケットを占めていると、GDP と Gβγサブユニット。解離、下流を開始するさらに G 蛋白質サブユニット (GαGTP と Gβγ) の Gαサブユニット結果に GDP を GTP のそれ以降の exchange はシグナリング経路2,3です。GαGTP が加水分解したとき再会 Gαの GDP と Gβγサブユニット G タンパク質戻るに変換その静止の状態3,4。G タンパク質の異なる種類が存在 (GsG のi/oGq、G12/13) を Gαサブユニット5配列の類似性に基づいて分類されます。すべてのこれらの G タンパク質は受容体活性化する生物学的反応の根底にある定義済みの細胞内シグナル伝達経路を誘発します。受容体活性化後は、GPCR キナーゼ (GRKs) は、β arrestins との相互作用の促進を図る、Gpcr の細胞内の尾をリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達、受容体の脱感作と内面の6の終了に します。Β arrestins、トリガー信号をカスケード G 蛋白質シグナリング7の独立した多分子複合体の一部です。
Gpcr は、治療的介入のほとんどの検証分子標的の中で多くの病因学に貢献する規制を解かれた GPCR を介したシグナル伝達、例えば機能獲得変異受容体遺伝子の受容体の過剰発現が原因人間の病気の8。したがって、Gpcr は製薬業界8,9,10を用いて創薬ターゲットの最も重要なクラスの 1 つを表します。臨床的に関連する GPCR の顕著な例は CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4)、唯一の天然リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)11によって活性化することができます。(HIV-1) ひと免疫不全ウイルス 1 の主要な共受容体として確立された役割のためのエントリ、クラスターの分化 4 (CD4) 抗ウイルス薬ターゲットとして肯定的な T リンパ球12, CXCR4 を調べた最初の感染。さらに骨髄に cxcl 12 CXCR4 相互作用調節保持し幹・前駆細胞のホーミング細胞13。また、がん生物学 (例えば、腫瘍細胞の生存、転移、腫瘍関連血管新生)14の多くの側面でいくつかその他疾患 (例えば、炎症性疾患)15, CXCR4 の関与を考える創薬のための有望なターゲットとして大きな関心を発生します。AMD3100, CXCR4 を標的とする低分子抗 HIV 薬候補16として発見された当初はまだ日付17に記載されている最も強力な CXCR4 アンタゴニストの一つ.その開発と抗ウイルス薬は、しかし、18は中止。現在この分子は、多発性骨髄腫とリンパ腫の患者のための18の治療中に幹細胞動員エージェントとして使用されます。いくつかの他の化学的に無関係な小さな分子や CXCR4 関数をさまざまな効力を抑制する生物学的製剤は、記述されている19をされています。
受容体結合メソッドは、関心の GPCR と直接対話する化合物 (例えば、小分子) を識別できるように薬理学の貴重なツールです。結合試験を実行するために、細胞内シグナル伝達のプロパティまたは特定の GPCR の機能に関する知識の必要はありません。これは利点であるためと考えられることができます、それは化合物が受容体の結合を示すことができますがさらに彼らの潜在的な敵対または敵対的活動を評価することによって特徴付けられる必要があることを意味します。この活動は、GPCR 研究の下に関連する薬理学的または生物学的アッセイを使用して評価できます。彼らの活動のプロファイルに依存して、受容体の結合の分子、潜在的になる進化可能性前臨床試験と臨床研究の調査のための新規リード化合物。高親和性受容体に特異結合する分子が腫瘍細胞20の生体内非侵襲イメージングのカイネティックスそれらによって例えば治療または診断ツールを生成するための足場として、または可能性としても利用できます。治療21のターゲットを絞った配信のための車。CXCR4 の場合腫瘍細胞の生体内イメージングが既に実証されているラベル CXCR4 ターゲット分子がひと癌異種移植片20,22,23 の視覚化を許可する前記マウスモデルを使用して.
本報告では、小分子と CXCR4 を拘束アゴニスト (cxcl 12) に直接干渉する生物学的製剤の照合することにより競争の結合の試金のための詳しいプロトコルについて述べる。アッセイの原理は蛍光リガンドの固定量間の競争 (cxcl 12AF647テーブルの材料および試薬を参照してください) と受容体タンパク質17,にバインドするための化合物をラベル24. CXCR4 を表現する 1 つのセルにバインドされている標識リガンドから特定の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーで分析しました。ラベルのない小さな分子 cxcl 12AF647と CXCR4 相互作用を混乱させるとき、この蛍光信号を差し引かれます。アッセイは、内生 CXCR4 を表現する非操作の細胞を使用して (すなわち、 Jurkat 細胞)。したがって、細胞膜の準備する必要がない便利な高速、スループットの向上と互換性のある試金になります。蛍光リガンドを利用していますので、放射能を避けます。
Cxcl 12 は CXCR4 の自然のアゴニスト、cxcl 12AF647バインディング アッセイに干渉する低分子化合物は orthosteric 受容体結合部位 (すなわち、結合部位が占め、自然と対話するにはアゴニスト)。Orthosteric 結合部位とは異なる地形的受容体結合部位と通信できる分子が気づかれ場合 cxcl 12 のバインディングには影響しません。例えば、このアッセイでの正と負のアロステリック変調、GPCR アロステリック結合サイト25に作用する分子をターゲットの重要な新たなカテゴリをピックアップされている可能性。さらに、受容体アンタゴニストやアゴニストとして化合物がこのバインディング アッセイ機能を識別されるかどうかは派生できません。その他、薬理学的または機能的受容体関連アッセイで同定された化合物の調査は従って必要となります。これらの試金は (の組み合わせ) を含めることが第二使徒 (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (cAMP))、表現型の検出細胞蛍光または発光ベース法または生物学的アッセイと β アレスチン募集の試金、どちらを調査の下で GPCR の特定信号プロパティによって異なります。したがって、主に本明細書に記載されている競争の結合の試金は、受容体結合能を持つ化合物の詳細な特性評価を有効にする他の細胞に基づく試金で補完する必要がある最初のスクリーニング法として機能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
結合の試金 (すなわち、飽和結合と動的バインディング実験) の他のタイプと比較して、競争の結合の試金は、スクリーニング目的に最も適しています。確かに、彼らは定額ラベル付き受容体リガンドの結合を妨害する能力の得点でラベルのない化合物、例えば小さい分子の大規模なバッチの評価ができます。標識リガンドよりも他の受容体部位に結合する化合物は、アッセイの検出さ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーンを感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
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