Un test Flow Cytometry d’identifier des composés qui perturbent la fixation du Ligand de chimiokines CXC fluorescent marqué 12 au récepteur de chimiokines CXC 4
Summary
Une coulée d’essai de liaison cellulaire axée sur la cytométrie en flux est décrite qui est principalement utilisée comme outil de dépistage pour identifier les composés qui inhibent la fixation d’un ligand de chimiokines CXC fluorescent étiquetée 12 (CXCL12) pour les récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4).
Abstract
Cible pharmacologique des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est d’une grande importance pour la santé humaine, comme dysfonctionnelle GPCR-mediated signaling contribue à la progression de nombreuses maladies. La paire de ligand/récepteur ligand de chimiokines CXC 12 (CXCL12) / récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4) a soulevé des intérêts cliniques significatifs, par exemple comme une cible potentielle pour le traitement du cancer et des maladies inflammatoires. Petites molécules ainsi que des anticorps thérapeutiques qui précisément ciblent CXCR4 et inhibent la fonction de récepteur sont donc considérés comme précieux outils pharmacologiques. Ici, un écoulement cytometry cellulaire test d’amplification qui permet l’identification de composés (par exemple, de petites molécules) qui abroge CXCL12 liaison à CXCR4, est décrite. Essentiellement, l’analyse se fonde sur la compétition pour récepteur liaison entre un montant fixe de CXCL12 fluorescent étiquetés, l’agoniste de chimiokine naturelle pour CXCR4 et composés sans étiquette. Par conséquent, l’utilisation indésirable de sondes marquées radioactivement est évitée dans cet essai. En outre, les cellules vivantes sont utilisés comme source de récepteur (CXCR4) au lieu de préparations de la membrane cellulaire. Cela permet une adaptation facile du dosage d’un format de plat, ce qui augmente le débit. Ce test s’est avéré être un test de découverte précieux médicament générique pour identifier les composés de ciblage CXCR4. Le protocole peut probablement être adapté aux autres RCPG, au moins si ligands fluorescent étiquetés sont disponibles ou peuvent être générés. Une connaissance préalable concernant les voies de signalisation intracellulaires qui sont induites lors de l’activation de ces RCPG, n’est pas nécessaire.
Introduction
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines de surface de cellules pouvant être activés par des ligands extracellulaires (p. ex., peptides, hormones protéiques, amines), donc réglementer beaucoup physiologique et le développement de procédés1. Quand un agoniste occupe sa poche de liaison de GPCR, le changement conformationnel induit dans la protéine réceptrice favorise la liaison d’intracellulaire récepteurs associés aux protéines G hétérotrimériques, consistant en Gα– PIB et sous-unitésβγ G. L’échange subséquent du GTP pour le PIB sur les résultats de sous-unitéα G dans la dissociation de les sous-unités de protéine G (Gα-GTP et Gβγ) qui, à son tour, va lancer plus loin en aval de signalisation des voies2,3. Lorsque le Gα-GTP est hydrolysé, re-association du Gα– PIB et sous-unitésβγ G convertira la protéine G dans son état au repos3,4. Différents types de protéines G existent (Gs, G,i/o, Gq, G12/13), qui sont classés par catégorie basée sur la similarité de séquence avec le G de sous-unitéα 5. Toutes ces protéines G induisent des voies de signalisation intracellulaire définis qui sous-tendent la réaction biologique à l’activation du récepteur. À la suite de l’activation des récepteurs, kinases GPCR (krg) phosphorylent la queue intracellulaire des RCPG, ce qui favorise une interaction avec le β-arrestins. Ce processus conduit à la résiliation de la signalisation, du récepteur de la désensibilisation et l’internalisation6G de protéines. Β-arrestins font également partie des complexes moléculaires multiples que le déclencheur de signalisation cascades indépendant de signalisation7G de protéines.
RCPG est parmi les cibles moléculaires plus validés pour une intervention thérapeutique, déréglementé GPCR signalisation médiée par, par exemple en raison du gain de fonction des mutations dans le gène du récepteur ou de la surexpression du récepteur, contribue à l’étiologie de la plupart 8de maladies humaines. Par conséquent, RCPG représente l’une des classes plus importantes de médicaments cibles étudiées par l’industrie pharmaceutique8,9,10. Un exemple notable d’un RCPG cliniquement pertinente est le récepteur de chimiokines CXC 4 (CXCR4), qui peut être activé par un ligand naturel unique, le CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. En raison de son rôle établi comme un corécepteur majeur pour 1, virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) entrée et infection en cluster de différenciation 4 (CD4) positive T-lymphocytes12, CXCR4 a d’abord étudié comme une cible de médicament antiviral. Domiciliation de souches et progénitrices cellules13et CXCL12-CXCR4 interaction dans la moelle osseuse plus régule la rétention. Aussi, compte tenu de son implication dans nombreux aspects de la biologie (p. ex., la survie des cellules tumorales, métastase, angiogenèse tumorale liées) de cancer du14 et plusieurs autres maladies humaines (p. ex., les maladies inflammatoires)15, CXCR4 a soulevé beaucoup d’intérêt comme une cible prometteuse pour la découverte de médicaments. AMD3100, une petite molécule qui vise spécifiquement les CXCR4, initialement détectée comme un anti-VIH médicament candidat16 et demeure l’un des plus puissants antagonistes CXCR4 décrits à la date17. Son développement comme un médicament antiviral a toutefois abandonné18. Actuellement, cette molécule est utilisée comme agent de mobilisation des cellules souches pendant le traitement du myélome multiple et lymphome patients18. Plusieurs autres non chimiquement apparentés de petites molécules et des produits biologiques qui inhibent la fonction CXCR4 avec puissance variable ont été décrits19.
Méthodes de liaison du récepteur sont des outils précieux en pharmacologie qui permettent l’identification des composés (par exemple, de petites molécules) qui interagissent directement avec la GRCP d’intérêt. Afin d’effectuer des études de liaison, il n’y a aucun besoin de connaissances préalables concernant les propriétés de signalisation intracellulaires ou fonctionnalités d’un RCPG donnée. Bien que cela peut être considéré comme un avantage, elle implique que composés pour quel récepteur liaison peut être prouvé doivent être davantage caractérisé en évaluant leur potentielle activité agoniste ou antagoniste. Cette activité peut être évaluée à l’aide de tests pharmacologiques ou biologiques associés à la GRCP sous étude. Selon leur profil d’activité, les molécules de liaison du récepteur pourraient alors potentiellement évoluer pour devenir composés de plomb roman d’enquête dans les études précliniques et cliniques. Les molécules qui se lient spécifiquement à un récepteur à haute affinité peuvent aussi servir comme échafaudages à créer des outils thérapeutiques ou diagnostiques, par exemple par radiomarquage eux pour l’imagerie non invasive en vivo de cellules de tumeur20, ou comme potentiel véhicules pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques,21. Dans le cas de CXCR4, l’imagerie in vivo de cellules tumorales a déjà été démontrée à l’aide de modèles de souris dans lequel des molécules marquées CXCR4 ciblage a permis la visualisation du cancer humain xénogreffes20,22,23 .
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole détaillé pour un test de fixation de concurrence qui permet l’identification de petites molécules et des produits biologiques qui interfèrent directement avec agoniste (CXCL12) contraignant à CXCR4. Le principe de base du dosage est la concurrence entre un montant fixe de ligand fluorescent étiqueté (CXCL12AF647, voir la Table des matières et réactifs) et non composés pour la liaison aux récepteurs protéiques17, 24. le signal fluorescent spécifique d’étiquetées ligand lié à des cellules individuelles exprimant le CXCR4 est ensuite analysé par cytométrie en flux. Ce signal fluorescent sera réduit lorsque non étiquetées de petites molécules perturbent l’interaction CXCL12AF647 / CXCR4. Le test utilise des cellules vivantes non manipulé endogène exprimant CXCR4 (c.-à-d., les cellules Jurkat). Par conséquent, aucune préparation de la membrane cellulaire n’est nécessaire, ce qui rend le test pratique, rapide et compatible avec un débit plus élevé. Comme un ligand fluorescent étiqueté est utilisé, la radioactivité est évitée.
CXCL12 étant l’agoniste naturel pour CXCR4, composés de petites molécules qui interfèrent avec la liaison CXCL12AF647 dans l’essai sont susceptibles d’interagir avec le site de liaison du récepteur orthosteric (c.-à-d., le site de liaison occupé par le naturel agoniste). Les molécules qui interagissent avec les sites de fixation de récepteurs topographiquement distincts de l’accepteur orthosteric ne sont pas détectés, si ils n’influencent pas la liaison de CXCL12. Par exemple, les MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs, une catégorie importante et émergente des RCPG ciblant les molécules agissant sur les sites de liaison allostérique25, seront potentiellement pas ramassés avec ce test. En outre, si les composés identifiés avec cette fonction de test de liaison agonistes ou antagonistes des récepteurs ne peuvent pas être dérivés. Enquête des composés identifiés dans les essais pharmacologiques ou fonctionnelles supplémentaires axés sur le récepteur sera donc nécessaire. Ces tests pourraient inclure (une combinaison de) cellulaire fluorescence ou luminescence-tests pour la détection des seconds messagers (p. ex., Ca2 +, adénosine monophosphate cyclique (AMPc)), phénotypiques ou dosages biologiques et la β-arrestine tests de recrutement, le choix dont dépend les signalisation des propriétés spécifiques de la GRCP sous étude. Par conséquent, le test de liaison compétitive décrit dans les présentes principalement sert un test de dépistage initial qui doit être complétée par d’autres analyses pour permettre à une caractérisation approfondie des composés avec puissance de fixation de récepteurs cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport à d’autres types d’essais de liaison (c.-à-d., liaison de saturation et des expériences de cinétique de fixation), analyses de liaison de compétition sont plus adaptés pour fins de présélection. En effet, ils permettent l’évaluation de grandes quantités de composés sans étiquette, par exemple de petites molécules, en marquant leur capacité d’interférer avec la fixation d’un montant fixe d’un ligand du récepteur marqué. Composés qui se lient à d’autres sites récepteur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Eric Fonteyn excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la KU Leuven (subvention no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant no. G.485.08) et la Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
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