Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören
Summary
Ein Flow Cytometry-basierten zellulären Bindung Assay beschrieben wird, die in erster Linie als Screening-Instrument verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, die die Bindung eines Eindringmittel beschrifteten CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) an den CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen.
Abstract
Pharmakologische Ausrichtung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ist von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit als dysfunktionale GPCR-vermittelten Signalisierung zu den Verlauf vieler Krankheiten beiträgt. Das Ligand-Rezeptor-paar CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) / CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hat erhebliches klinische Interesse, zum Beispiel als ein potenzielles Ziel für die Behandlung von Krebs und entzündliche Erkrankungen erhöht. Kleine Moleküle sowie therapeutische Antikörper, die spezifisch CXCR4 und hemmen die Rezeptor-Funktion gelten daher als wertvolle pharmakologische Werkzeuge. Hier wird ein Flow Cytometry-basierten zellulären Assay, der Identifizierung von Verbindungen (z. B. kleine Moleküle) ermöglicht, die CXCL12 Bindung an CXCR4, aufzuheben beschrieben. Im wesentlichen stützt sich der Test auf den Wettbewerb für die Rezeptor-Bindung zwischen einen Festbetrag von Eindringmittel beschrifteten CXCL12, die natürliche Chemokin-Agonist für CXCR4 und unbeschriftete Verbindungen. Daher ist die unerwünschte Verwendung von radioaktiv markierte Sonden in diesem Assay vermieden. Darüber hinaus sind lebende Zellen als Quelle des Rezeptors (CXCR4) anstelle von Zellmembran Vorbereitungen verwendet. Dies ermöglicht eine einfache Anpassung des Assays zu einem Plattenformat, das den Durchsatz erhöht. Dieser Test hat sich gezeigt, zu einem wertvollen Generika Entdeckung Assay, CXCR4-targeting Verbindungen zu identifizieren. Das Protokoll kann wahrscheinlich andere GPCRs mindestens angepasst wenn Fluoreszent markierte Liganden zur Verfügung stehen oder erzeugt werden können. Vorkenntnisse über die intrazelluläre Signalwege, die durch die Aktivierung dieser GPCRs verursacht werden ist nicht erforderlich.
Introduction
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind Zelle Oberflächenproteine, die von extrazellulären Liganden (z. B. Peptide, Proteinhormone, Amine) aktiviert werden können, dadurch regulieren viele physiologische und entwicklungspolitische Prozesse1. Wenn ein Agonist seine GPCR-Bindungstasche einnimmt, induzierte Konformationsänderung im Rezeptor-Protein fördert die Bindung von intrazellulären Rezeptor-assoziierten Heterotrimeric G Proteine, bestehend aus Gα– BIP und Gβγ Untereinheiten. Der anschließende Austausch von GTP für das BIP auf der Gα -Untereinheit resultiert die Dissoziation der G Protein Untereinheiten (α-GTP G und Gβγ), die wiederum weiter flussabwärts initiieren Signalisierung Wege2,3. Wenn die Gα-GTP hydrolysiert wird, erneute Vereinigung Gα– BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein wieder in seiner ruhenden Zustand3,4umwandeln. Verschiedene Arten von G-Proteine vorhanden (GsGi/oGQ, G12/13), die kategorisiert sind, anhand der Reihenfolge Ähnlichkeit mit dem Gα -Untereinheit5. Alle diese G-Proteine induzieren definierte intrazellulären Signalwege, die die biologische Reaktion auf Rezeptor-Aktivierung zugrunde liegen. Im Anschluss an den Rezeptor-Aktivierung phosphorylieren GPCR Kinasen (GRKs) der intrazellulären Schweif von GPCRs, dadurch Förderung der Interaktion mit β-Arrestins. Dieser Prozess führt zur Beendigung des G Protein signaling, Rezeptor Desensibilisierung und Internalisierung6. Β-Arrestins sind ebenfalls Teil der Multi-molekulare komplexe, dass Trigger Signal unabhängig von G Protein signaling7Kaskaden.
GPCRs gehören zu der am besten validierten molekularen Zielstrukturen für eine therapeutische Intervention, da deregulierten GPCR-vermittelten Signalisierung, zum Beispiel durch Gain-of-Function-Mutationen in der Rezeptor-Gens oder Rezeptor-Überexpression, zur Ätiologie von vielen beiträgt Krankheiten des Menschen8. Daher sind GPCRs eines der wichtigsten Klassen von Angriffspunkte für Medikamente durch die Pharmaindustrie8,9,10untersucht. Ein bemerkenswertes Beispiel von einer klinisch relevanten GPCR ist der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4), der durch eine einzige natürliche Liganden, der CXC Chemokin Liganden 12 (CXCL12)11aktiviert werden kann. Aufgrund der etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) Eintrag und Infektion im Cluster der Differenzierung 4 (CD4) positiven T-Lymphozyten12, CXCR4 wurde zuerst als antivirale Medikament Ziel untersucht. CXCL12-CXCR4 Interaktion im Knochenmark weiter regelt die Aufbewahrung und Homing von Stamm- und Vorläuferzellen Zellen13. Auch sein Engagement in vielen Aspekten der Krebs-Biologie (z. B. Tumor Zelle überleben, Metastasen, Tumor-bezogene Angiogenese)14 und mehrere andere Krankheiten des Menschen (z. B. entzündliche Krankheiten)15, CXCR4 gegeben erhebliches Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung angehoben. AMD3100, ein kleines Molekül, das richtet sich speziell an CXCR4, wurde zunächst als eine Anti-HIV-Medikament Kandidat16 entdeckt und ist immer noch eines der potentesten CXCR4-Antagonisten bis Datum17beschrieben. Seine Entwicklung als eine antivirale Medikament jedoch wurde eingestellt18. Derzeit ist dieses Molekül als Stammzell-Mobilisierung während der Behandlung des multiplen Myeloms und Lymphom Patienten18verwendet. Mehrere andere chemisch nicht verwandten kleine Moleküle und Biopharmazeutika, die CXCR4 Funktion mit unterschiedlicher Potenz hemmen wurden beschrieben19.
Rezeptor-Bindung-Methoden sind wertvolle Werkzeuge in der Pharmakologie, die es ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen (z. B. kleine Moleküle), die direkte Interaktion mit der GPCR von Interesse. Um verbindliche Studien durchzuführen, ist ohne vorherige Kenntnis der intrazellulären Signal Eigenschaften und der Funktionsweise von einem bestimmten GPCR. Obgleich dies als Vorteil betrachtet werden kann, bedeutet es, dass Verbindungen für welche, die Rezeptor Bindung nachgewiesen werden kann weiter charakterisiert werden, durch die Auswertung ihrer potenziellen agonistischen und antagonistischen Aktivität müssen. Diese Aktivität kann mit pharmakologischen oder biologische Assays im Zusammenhang mit der GPCR unter Studie ausgewertet werden. Abhängig von ihrem Tätigkeitsprofil, verbindliche Rezeptormoleküle dann möglicherweise entstehen um neuartige Bleiverbindungen zur Untersuchung in präklinischen und klinischen Studien werden. Moleküle, die gezielt an einen Rezeptor mit hoher Affinität binden können auch als Gerüste therapeutische oder diagnostische Werkzeuge, zum Beispiel generieren, indem sie für die nicht-invasive in-Vivo Bildgebung von Tumor Zellen20, enzymatische oder Potenzial dienen. Fahrzeuge für gezielte Bereitstellung von Therapeutika21. Im Falle von CXCR4 in-Vivo Bildgebung von Tumorzellen bereits nachweislich mit Mausmodellen wobei beschrifteten CXCR4-targeting Moleküle die Visualisierung von Krebserkrankungen Xenotransplantate20,22,23 erlaubt .
In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen Wettbewerb-Bindung-Assay, der es ermöglicht die Identifikation von kleinen Molekülen und Biologics, die direkt mit Agonist (CXCL12) verbindlich zu CXCR4 stören. Das grundlegende Prinzip des Tests ist der Wettbewerb zwischen einen Festbetrag von Eindringmittel markierten Liganden (CXCL12AF647, siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) und stumme Verbindungen für die Bindung an den Rezeptor-Protein17, 24. das bestimmte Fluoreszenzsignal aus markierten Liganden gebunden, einzelne Zellen mit dem Ausdruck CXCR4 wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Fluoreszenzsignal wird verringert, wenn unbeschriftete kleine Moleküle die Interaktion zwischen CXCL12AF647 und CXCR4 stören. Der Assay verwendet nicht manipulierten lebenden Zellen, die endogen CXCR4 ausdrücken (d. h. Jurkat-Zellen). Daher ist keine Zellmembran Vorbereitung erforderlich, wodurch der Assay, bequem, schnell und kompatibel mit erhöhter Durchsatz. Da eine Fluoreszent markierten Liganden verwendet wird, wird Radioaktivität vermieden.
Da CXCL12 den natürlichen Agonist für CXCR4 ist, dürften niedermolekulare Verbindungen, die CXCL12AF647 Bindung in der Probe stören die Interaktion mit der Orthosteric-Rezeptor-Bindungsstelle (d. h. die Bindungsstelle von natürlichen besetzt Agonist). Moleküle, die mit Rezeptor Bindungsstellen topographisch unterscheidet sich von der Orthosteric-Bindungsstelle interagieren würde bleiben unentdeckt, wenn sie die Bindung von CXCL12 keinen Einfluß haben. Zum Beispiel werden positive und negative allosterische Modulatoren, eine wichtige und neue Kategorie von GPCR targeting Moleküle auf allosterische Bindung Seiten25, möglicherweise nicht mit dieser Assay abgeholt. Darüber hinaus, ob die Verbindungen mit dieser Bindung-Assay-Funktion als Rezeptor-Antagonisten oder Agonisten identifiziert kann nicht abgeleitet werden. Untersuchung der identifizierten Verbindungen in zusätzliche pharmakologische oder funktionellen Rezeptor-bezogene Tests werden somit benötigt. Diese Tests beinhalten (eine Kombination aus) zellulären Fluoreszenz oder Lumineszenz basierende Assays zum Nachweis von sekundären Botenstoffen (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP)), phänotypische oder biologische Assays und β-arrestin Rekrutierung-Assays, richtet sich die Wahl von denen auf die spezifischen Eigenschaften der Signalisierung von GPCR unter Studie. Daher dient die wettbewerbsfähige Bindung Assay hierin vor allem beschrieben als ein erstes Screening-Test, die mit anderen zellbasierte Assays ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Verbindungen mit der Rezeptor-Bindung-Potenz ergänzt werden muss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu anderen Arten der Bindung-Assays (z. B. Sättigung Bindung und kinetische verbindliche Experimente), sind Wettbewerb-Bindung-Assays am besten geeignet zu screening-Zwecken. In der Tat, ermöglichen sie Bewertung von Großserien unbeschriftete Verbindungen, zum Beispiel kleine Moleküle durch scoring ihre Fähigkeit, die Bindung eines Festbetrags eines beschrifteten Rezeptor Liganden stören. Verbindungen, die an andere Rezeptoren als die markierten Liganden binden könnte im Test unentdeckt zu bl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Eric Fonteyn für ausgezeichnete technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08) und der Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
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