Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.
NƐ– asilasyonu tarafından protein lizin kalıntılarının translasyonel modifikasyon (PTM) dinamik olarak protein işlevler, örneğin, enzimatik aktivite değiştirerek veya etkileşimlerin arabuluculuk düzenleyen yapısal değişiklikler neden olmaktadır. Siteye özel protein asilasyonu doluluk veya stoichiometry, kesin miktar fonksiyonel sonuçları genel alt düzey stoichiometry ve belirli lizin bireysel üst düzey asilasyonu stoichiometry anlamak için gerekli artıkları. Diğer gruplar peptid habercisi izotoplar endojen, doğal bereket asilasyonu üzerinden oranını karşılaştırarak lizin asetilasyon stoichiometry ölçümü bildirdin ve eksojen, ağır izotop etiketli asilasyonu tanıttı sonra nicel kararlı izotop etiketli asetik anhidrit kullanarak proteinlerin kimyasal asetilasyon. Bu iletişim kuralı da dahil olmak üzere çeşitli iyileştirmeler featuring en iyi duruma getirilmiş bir yaklaşım açıklar: artan (1) kimyasal asilasyonu verimlilik, (2) protein succinylation yanı sıra asetilasyon ölçmek için yetenek ve (3) geliştirilmiş nedeniyle nicel doğruluğu azaltılmış etkileşimler habercisi iyon sinyal veri bağımlı edinme (DDA) yerine parçası iyon miktar üzerinden veri bağımsız satın almalar (DIA) kullanarak. Miktar parçası iyonları alanlarından ayıklanan tepe kullanımını da benzersiz olarak site düzeyinde asilasyonu stoichiometry proteolitik peptidler habercisi iyon kullanarak mümkün değil birden fazla lizin kalıntı içeren gelen farklılaşma etkinleştirir miktar için sinyalleri. Veri görselleştirme manzarası, bir açık kaynak nicel proteomik ortam içinde uygun veri denetim ve inceleme için sağlar. Birlikte, bu iş akışını siteye özgü lizin asetilasyon ve succinylation İskan izni ortaya çıkarmak ve biyolojik olarak ilgili asilasyonu siteleri öncelik bir tüm Proteom, tarafsız, kesin ve doğru miktar sunmaktadır.
NƐ– asilasyonu protein lizin kalıntılarının protein işlevinin önemli bir düzenleyicisidir. Lizin asetilasyon ve diğer acylations, succinylation, malonylation ve glutarylation, gibi metabolizma, hücre sinyallemesi ve diğer hücresel süreçler1,2,3,4 düzenleyen düşünülmektedir , ve metabolik bozukluklar5‘ te vardır. Çok sayıda çalışma bulduk lizin asil değişiklikler memeli dokularda farklı koşullar altında büyük kat değişiklikleri meydana ve hücre hatları5,6,7,8 gibi bakteri9,10,11, ancak, bu göreli kat değişiklikleri değiştiren toplam protein oranının ilgili bilgiler sağlar. Ölçümleri asilasyonu sitesi İskan izni kıt12,13,14, alaka rağmen vardır ve bu tür çalışmalar için ihtiyaç göreli kat daha fazla detay sağladıkları olarak raporlama çalışmaları değiştirin. Örneğin, 10 kat bir değişiklik bir site doluluk artış 0,01 den % 0.1, 1-%10 veya hatta 10-%100 için temsil edebilir. Doğru stoichiometry ölçümleri asilasyonu biyolojik önemi yorumlamak ve etkisi protein yapısal, büyüklüğü ile ilgili tahmin etmek için gerekli olan ve muhtemelen, fonksiyonel değişiklikler.
Site doluluk ölçmek için bir önceki yöntem ağır kararlı izotop kimyasal ile karşılaştırıldığında eksojen endojen “ışık” asetilasyon arasındaki oran ölçmek için kütle spektrometresi ardından değiştirilmemiş lizin kalıntılarının etiketleme kullanır, kimyasal olarak etiketli “ağır” asetil-lizin habercisi iyon yoğunluklarda12kullanarak. Zhou ve arktarafından yeni bir çalışma daha. Ayrıca tam bir kimyasal asetilasyon proteinler bütün değiştirilmemiş lizin kalıntılarının kararlı izotop etiketleme ile çalışan ama tarafından ölçülen parça iyon yoğunluklarda kullanılan lizin asetilasyon stoichiometry değerlendirmek için benzer bir yaklaşım 13 açıklanan DDA. Nakayasu ve ark. 14 benzer bir DDA yaklaşım kullanılan, ancak bunun yerine hafif ve ağır asetil-lizin immonium iyonlarının oranı miktar için kullanılan. Parça iyonları üzerinde temel miktar immonium veya sıra iyonları (MS2), bozulmamış peptid habercisi iyonları (MS1) işleme için karşılaştırıldığında daha az Sinyal parazit türleri çoğu durumlarda sonuçlarında. Ancak, miktar parçası iyonlar DDA tarafından oluşturulan MS/MS spectra dan rassal örnekleme eksiklikler, nerede yüksek-bereket habercisi iyonları MS/MS için seçilmesi ve bu nedenle bir önyargılı ve eksik örnekleme için neden olasılığı daha yüksektir muzdarip öncü iyonları.
Bu yeni iş akışı4 (Resim 1) kavramsal olarak kararlı izotop yaklaşım aslında Baeza ve arktarafından geliştirilmiş etiketleme kimyasal kullanır. 12, ancak iş akışı daha sonra birleştiğinde DIA ile her iki öncü toplamak için ve birden çok parça iyon zenginliği tespit kitle üzerinde doğru stoichiometry hesaplamalar sağlayan15,16 Aralık.
Tepe alanları ilgi asilasyonu sitesi içeren iyonları parçası veya ‘parçası iyonları ayırt’, asilasyonu sitesi doluluk (Şekil 2) ölçmek için kullanılır. Değişiklik içermeyen parçası iyonları aynı hafif ve ağır m/z değerleri olan ve peptid kimlik için ancak miktar için kullanılır. Manzarası yazılım17 habercisi ve parça pik alanları için kullanılır. Etkileşimler parçası iyonları bazılarında ortaya çıkarsa bir verilen asilasyonu site içeren birden çok parça iyonları varlığı esneklik sağlar. Veri görselleştirme manzarası içinde ışık ağır parça iyon oranları eleştirel incelenmesi için izin verir. El ile veri analizi ek olarak, şirket içinde StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), yazılı bir açık kaynak R paketi, hangi DIA toplanan habercisi iyon ve parça iyon verileri kullanır ve quantifies geliştirilmiştir birden çok lizin artıkları, öncü salt iyon yoğunluk ölçümleri4ile mümkün değil bir özellik içeren peptidler üzerinden siteye özgü asilasyonu stoichiometry.
Bu iletişim kuralı da endoproteinase Glu-C, C-terminal bölünme, glutamik ve aspartik asit artıkları gibi ikinci kez çok büyük oluşturmak ve potansiyel olarak çarpma tripsin veya Arg-C proteaz, kullanmak yerine, belirli kullanımını gösterir acylated proteolitik peptidler kaynaklanan tripsin bölünme acylated lizin artıkları, engelledi. Yordam etiketleme kimyasal da süksinik anhidrit (şekil 1), böylece succinylation stoichiometry succinylation miktar etkinleştirme kullanımını içerecek şekilde genişletildi. Numune hazırlama, peptid ayırma pH, çevrimdışı, temel tarafından uygulanması için iyileştirmelerine ek olarak daha fazla peptidler ayrılması ters faz (bRP) miktar etkileşimler, daha iyi de-evrişim izin azalmıştır Bütün Proteom örneklerinde asilasyonu stoichiometry. Birlikte, bu yöntem ve özellikleri çeşitli avantajlar vurgular: (1) verimlilik artışı kimyasal asilasyonu; (2) protein succinylation stoichiometry yanı sıra asetilasyon ölçümü; ve (3) geliştirilmiş miktar doğruluk. Geliştirilmiş miktar azalan etkileşimler parçası iyon sinyalleri DDA habercisi sinyal yanı sıra devre dışı peptid ön ayırma uygulanması bRP tarafından karşılaştırıldığında DIA kaynaklanmaktadır.
Bu iletişim kuralı bir roman ve siteye özgü lizin asetilasyon ve tüm bir Proteom uygulanabilir succinylation doluluk ölçmek için bir yöntem sağlar. Ölçüm endojen ışık peptidler ve eksojen ağır peptidler, ikincisi olan vardır oluşturulan vitro proteinlerin kantitatif kimyasal asilasyonu deuterated asetik anhidrit –d6 ile kullanarak bu yöntemi kullanır veya süksinik anhidrit –d4 (şekil 1). Benzer yöntemleri istikrarlı izotopik yerli değiştirilmemiş lizin artıkları etiketleme kullanılan ve site doluluk miktar ya da habercisi salt iyon12 veya parça iyonları DDA satın almalar13,14temel gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralı birkaç adım asilasyonu etkinliğini artırmak için numune hazırlama sırasında uygular ve kimyasal succinylation için etiketleme uzanır. DIA satın almalar kullanarak veri koleksiyon habercisi iyon ve MS2 parçası böylece parçası iyon etkileşimler azaltarak tüm tespit kitle aralığında, iyon yoğunluklarda alır. Analiz ve miktar manzarası ve şirket içinde geliştirilen özel komut dosyaları üzerinden birden fazla lizin kalıntı ve bir sitede birden fazla asilasyonu içeren peptidler için site doluluk hesaplamasına izin.
Yakından takip edilmesi gereken bu protokol örnek hazırlama aşamasında çeşitli kritik adımlar vardır. Tüm iletişim kuralı tüm lizin artıkları verimli kimyasal modifikasyonu dayanıyor beri bu adımı son derece önemlidir. Amin içeren arabellek veya kirletici moleküllerin lysate proteini içerisinde kaçınılması gerekir bu yüzden anhidritler ücretsiz aminler ile tepki. Ayrıca kimyasal asilasyonu adımı sırasında reaksiyon karışımı pH geri pH 8 her anhidrit reaktif ile üç incubations sonra bu tepkime karışımı acidifies ve O-asilasyonu yan-reaksiyonlar oluşabilir gibi ayarlanır emin olun. Ayrıca, seyreltme karışımı 8 M üre içeren tepki için en uygun aralığındaysa pH 0, 8 M üre önce sindirim ve kontrol etrafında endoproteinase Glu-c en uygun etkinlik için önemlidir Başka bir anahtar, bizim iletişim kuralı veri toplama adım ve hangi DDA veri örnekleme tutarsızlıkları üstesinden gelir ve miktar MS2 parçası iyon düzeyinde için izin veren bir DIA iş akışı, giriş bileşenidir. DIA metodoloji bir ana avantajı olan genellikle ne zaman (önceki yayın bazıları olarak) MS1 habercisi iyon sinyal miktarının çok daha eğilimli ve sorunlu etkileşimler azalmadır.
İş akışı için birkaç değişiklik son derece karmaşık örnekleri hazırlarken yapılabilir. Sonra çevrimdışı basic-pH ters faz HPLC ayırma LC/MS. Ayrıca tarafından Kromatografik degradeler artık bu can da elde havuza alınan örnekleri karmaşıklığı düşürmek için azalmıştır havuza alınmış kesirler sayısı sırasında kullanılan daha iyi peptid ayrılması için izin vermek için satın alma. Alternatif olarak, birden çok proteaz i ciddi peptidler büyük çeşitli üretmek ve protein lizin artıkları kapsamını artırmak için örnekleri sindirmek için kullanılabilir. Deneme çalışır ve en iyi duruma getirme ticari BSA asetilasyon veya succinylation belirli oranlarda içeren kullanarak yapılabilir.
Bu iletişim kuralı için bir sınırlama potansiyel olarak hafif sitesi doluluk tahmindi nedeniyle metilasyonu veya ubiquitination, vb, aynı site4gibi diğer lizin değişiklikleri kayıp olduğunu. Hafif ve ağır asil değişiklikler, L/(L+H), en yüksek alanlardan hesaplanan site doluluk değişiklik bir lisin sitede Toplam düzeyini yalnızca endojen ‘ışık’ asilasyonu (L) oluşur duymadığını ve kimyasal olarak ‘ağır’ etiketli asilasyonu (H). Ancak, bir site içinde vivo , gerçek toplam asilasyonu doluluk asetilasyon ve/veya succinylation ötesinde diğer değişiklikleri içerebilir. Ayrıca, bildirilen izotopik saflık satın alınan reaktifler asetik anhidrit –d6 (% 99) ve süksinik anhidrit –d4 (> % 98’i) için ilâ %2 (succinyl) veya % 1’i (asetil) küçük bir tahmindi katkıda bulunabilir endojen asilasyonu düzey4. Birlikte, bu hafif overestimations az % 1 sitesine miktarının zorluk eklemek doluluk. Büyük bereket farklılıklar arasında tam kimyasal olarak acylated peptidler ve yerel acylated peptidler de özellikle düşük endojen acylated peptidler27için potansiyel site doluluk miktar hataları katkıda bulunur. Weinert ve arktarafından yeni bir çalışma. 27 tam acetylated peptidler arasındaki farklar azaldı bereket miktar hata27azaltabilir buldu.
Bu protokolü kullanarak toplanan stoichiometry quantifications önemli asilasyonu mutagenesis ilgi belirli sitelerin site yönettiği gibi biyolojik izleme denemeleri için belirli bir protein ve form hipotezler etkin noktalar saptamak. Bu iletişim kuralı da protein yapısal kararlılık dolaylı ya da ince etkiler sarfetmek ve hücresel ortamlar lokalize düşük asilasyonu stoichiometry siteleri kombine etkileri ortaya. Ayrıca, asetilasyon ve succinylation ve asetilasyon ötesinde diğer olası lizin asilasyonu değişiklikleri ölçmek için bu iletişim kurallarını uygulanması benzersiz dinamik asilasyonu etkileri altında farklı proteinler üzerinde anlayışlar sunacak biyolojik koşullar.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser NIH Ulusal diyabet Enstitüsü tarafından desteklenen ve sindirim ve böbrek hastalıkları NIH-NIDDK hibe R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM NIH T32 arkadaş grubu tarafından desteklenen (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Yazarlar NIH destek araçları hibe Buck Enstitüsü’nde TripleTOF 6600 sistem için paylaşılan kabul (1S10 OD016281, PI: BW Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |