Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.
Modificación poste-de translación (PTM) de residuos de lisina de la proteína porƐN – acilación induce cambios estructurales que dinámicamente pueden regular las funciones de la proteína, por ejemplo, por cambio de actividad enzimática o por mediación de las interacciones. Cuantificación precisa de la ocupación de Acilación de proteína específica o la estequiometría, es esencial para la comprensión de las consecuencias funcionales de la estequiometría global de bajo nivel y acilación alto nivel individual de estequiometría de lisina específico residuos. Otros grupos han informado de medición de la estequiometría de lisina acetilación mediante la comparación de la proporción de isótopos de péptido precursor de la acilación de la abundancia natural, endógena y exógena, pesado isótopo-etiquetada acilación introducido después cuantitativa química acetilación de proteínas utilizando anhídrido acético marcado con el isótopo estable. Este protocolo describe un enfoque optimizado con varias mejoras, incluyendo: (1) aumento de la acilación química eficiencia, (2) la capacidad de medir la succinylation de la proteína además de acetilación y (3) mejoró la exactitud cuantitativa debido a interferencias reducidas mediante cuantificación de iones fragmento de adquisición de datos-independiente (DIA) en lugar de la señal de ion precursor de adquisición de datos dependientes (DDA). El uso extraídos de zonas de pico de iones fragmento para la cuantificación permite también una diferenciación de nivel de sitio acilación estequiometría de proteolíticas péptidos que contienen más de un residuo de lisina, que no es posible usar ion precursor señales para la cuantificación. Visualización de datos en el horizonte, un entorno de proteómica cuantitativa de código abierto, permite la revisión y la inspección de datos conveniente. Juntos, este flujo de trabajo ofrece cuantificación imparcial, exacta y precisa de site-specific lisina acetilación y succinylation de ocupación de un proteoma completo, que puede revelar y dar prioridad a sitios de acilación biológicamente relevantes.
ƐN – Acilación de restos de lisina de la proteína es un importante regulador de la función de la proteína. Acetilación de la lisina y otros acylations, como succinylation, malonylation y glutarylation, se cree que regulan el metabolismo, señalización celular y otros procesos celulares1,2,3,4 , y tienen implicaciones en trastornos metabólicos5. Numerosos estudios han encontrado que lisina acil modificaciones someterse a grandes cambios de fold bajo diferentes condiciones en tejidos mamíferos y líneas5,6,7,8 de la célula, así como las bacterias9,10,11, sin embargo, estos cambios de doblez relativa no proporcionar penetraciones en la proporción de la proteína total modificada. Los estudios que informaron las medidas de ocupación del sitio de acilación son escasos12,13,14, a pesar de la importancia y necesitan de tales estudios ya que proporcionan más detalles que pliegue relativo el cambio. Por ejemplo, un cambio 10 veces podría representar un aumento de ocupación del sitio de 0.01 a 0.1%, 1 a 10% o incluso 10 a 100%. Mediciones de estequiometría exacta se requiere interpretar el significado biológico de la acilación y predecir el impacto sobre la magnitud de la proteína estructural y, posiblemente, cambios funcionales.
Uno de los métodos anterior para cuantificar la ocupación del sitio utiliza pesado isótopos estables química de etiquetado de los residuos de lisina seguidas de espectrometría de masas para medir la relación entre endógeno acetilación “light” en comparación con los exógenos, etiquetado químicamente “pesada” acetil-lisina con precursor ion intensidades12. Otro reciente estudio realizado por Zhou et al. 13 describe un enfoque similar para determinar la estequiometría de la acetilación de la lisina que también empleó una acetilación química completa de todos los residuos de lisina sin modificaciones en las proteínas con isótopos estables de etiquetado, pero utilizado intensidades de iones fragmento según lo medido por PDD. Nakayasu et al. 14 utiliza un enfoque similar de la PDD, pero en su lugar utiliza el cociente de iones immonium de acetil-lisina ligera y pesada para la cuantificación. Cuantificación basada en iones del fragmento, immonium o secuencia de iones (MS2), en la mayoría de casos de resultados en menos interferencias de señal en comparación con el proceso los iones intactas péptido precursor (MS1). Sin embargo, la cuantificación de iones fragmento de espectros MS/MS DDA genera puede padecer deficiencias de muestreo estocástico, donde son más propensos a ser seleccionado para MS/MS y por lo tanto, conducir a una muestra sesgada e incompleta de los iones precursores de alta abundancia iones precursores.
Este nuevo flujo de trabajo4 (figura 1) expresiones utiliza un isótopo estable químico etiquetado enfoque desarrollado originalmente por Baeza et al. 12, sin embargo el flujo de trabajo es posteriormente junto con el DIA a recoger ambos precursores y múltiples abundancias de iones fragmento sobre la masa perceptible gama15,16 proporcionar cálculos de estequiometría exacta.
Áreas de pico de fragmentan los iones que contienen el sitio de Acilación de interés o ‘diferenciar los iones fragmento’, se utilizan para cuantificar la ocupación del sitio de acilación (figura 2). Los iones fragmento que contiene la modificación tienen valores idénticos ligeras y pesadas m/z y se utilizan para la identificación de péptidos pero no para la cuantificación. Skyline software17 se utiliza para extraer áreas de picos precursor y fragmento. La presencia de varios iones fragmento que contiene un sitio de acilación dado proporciona flexibilidad si se detectan interferencias en algunos de los iones del fragmento. Visualización de datos en el horizonte permite inspección crítica de la relación de iones fragmento de ligero a pesado. Además de análisis de datos manual, un paquete de R de código abierto escrito en el local, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), fue desarrollado, que utiliza el precursor ion y fragmento ion datos recogidos a través de DIA y cuantifica estequiometría de acilación específica de péptidos que contienen varios residuos de lisina, una característica que no es posible con precursor ion sólo intensidad medidas4.
Este protocolo también muestra el uso de endoproteinasas Glu-C, que es específica para el escote de la terminal C en los residuos de ácido aspártico y glutámico, en lugar de utilizar la tripsina o la proteasa Arg-C, como el último a menudo genera muy grande y potencialmente se multiplican acilada proteolítica péptidos resultantes bloquean escote de tripsina en los residuos de lisina acilados. El químico procedimiento de etiquetado también se amplió para incluir uso de anhídrido succínico (figura 1), permitiendo la cuantificación de succinylation succinylation de estequiometría. Además de mejoras en la preparación de la muestra, la aplicación del fraccionamiento de péptido de pH básico, sin conexión, separación de fase inversa (bRP) de péptidos más disminución de interferencias de cuantificación, lo que permite mejor la convolución de estequiometría de acilación en muestras de proteoma conjunto. Juntos, este método incluye y destaca varias ventajas: (1) aumentar la eficiencia de acilación química; (2) medición de la estequiometría de succinylation de proteína además de acetilación; y (3) cuantificación mayor precisión. La cuantificación de la mejora es debido a disminución interferencias en las señales de iones fragmento de diámetro comparado con señal de precursor del PDD, así como la implementación de fraccionamiento anterior péptido fuera de línea por bRP.
Este protocolo proporciona un novedoso y preciso método para cuantificar la acetilación de la lisina específica y ocupación succinylation que puede aplicarse a un proteoma completo. Este método se basa en la medición de péptidos luz endógenas y exógenas péptidos pesados, el último de los cuales es generados en vitro con acilación química cuantitativa de proteínas deuterados anhídrido acético –d6 o succínico anhídrido –d4 (figura 1). Métodos similares han utilizado etiquetado isotópico estable de residuos de lisina nativos y realiza la cuantificación de la ocupación de sitio basada en ya sea precursor ion sólo12 o fragmento iones del PDD adquisiciones13,14. Este protocolo aplica varios pasos durante la preparación de la muestra para mejorar la eficiencia de la acilación y extiende el etiquetado de productos químicos a succinylation. Colección de datos mediante adquisiciones DIA obtiene ion precursor y fragmento de MS2 intensidades de iones sobre la gama entera de masa detectable, reduciendo así las interferencias de iones fragmento. Análisis y cuantificación via horizonte y scripts personalizados desarrollados permiten el cálculo de ocupación de sitio para péptidos que contienen más de un residuo de lisina y acilación más de uno en uno.
Hay varios pasos críticos durante la etapa de preparación de muestra de este protocolo que debe seguirse de cerca. Puesto que el conjunto del Protocolo se basa en la modificación química eficiente de todos los residuos de lisina, este paso es de suma importancia. Anhídridos reaccionan con aminas libres, así que contiene amina buffer o contaminante las moléculas en el lisado de proteínas se deben evitar. También durante la etapa química por acilación, asegúrese de que el pH de la mezcla de reacción se ajusta a pH 8 después de cada una de las tres incubaciones con reactivo de anhídrido como esta reacción acidifica la mezcla, y acilación O reacciones secundarias pueden formar. Además, la dilución de la 8 M urea que contiene mezcla de reacción a alrededor de 0,8 M de urea antes de la digestión y comprobar que el pH esté dentro del rango óptimo es importante para la actividad óptima de endoproteinasas Glu-C. Otro componente clave de nuestro protocolo es el paso de la colección de datos y la introducción de un flujo de trabajo DIA, que supera cualquier inconsistencia de muestreo de datos DDA y que permite la cuantificación en el nivel de iones fragmento de MS2. Una de las ventajas principales de la metodología DIA es la disminución de interferencias que suelen ser mucho más problemático y propenso al cuantificar la señal de ion precursor de MS1 (como han sugerido algunos de las publicaciones anteriores).
Pueden hacerse varias modificaciones al flujo de trabajo durante la preparación de muestras altamente complejas. El número de fracciones agrupados después de que el fraccionamiento de HPLC de fase inversa basic-pH sin conexión puede reducirse para disminuir la complejidad de las muestras agrupadas que será adquirida por LC/MS. Adicionalmente, ya cromatográfico gradientes puede también ser utilizado durante adquisición para permitir la mejor separación del péptido. Como alternativa, pueden usarse varias proteasas para digerir muestras para producir una mayor variedad de péptidos exfoliados y aumentar la cobertura de los residuos de lisina de la proteína. Pistas de ensayo y optimización pueden realizarse utilizando BSA comercial que contengan porcentajes específicos de acetilación o succinylation.
Una limitación en el presente Protocolo es sobreestimación de ocupación del sitio potencialmente leve debido a otras modificaciones de la lisina, como la metilación o ubiquitinación, etc., en el mismo sitio4cuyo paradero se desconoce. Calculada a partir de las áreas pico de modificaciones ligeras y pesadas acil, L/(L+H), la ocupación del sitio se basa en la suposición de que el nivel total de modificación en un sitio de lisina consiste en sólo endógeno acilación ‘light’ (L) y químicamente con la etiqueta ‘pesada’ acilación (H). Sin embargo, la ocupación de acilación total real en un sitio en vivo puede incluir otras modificaciones más allá de la acetilación o succinylation. Además, la pureza isotópica divulgada de los reactivos comprados anhídrido acético –d6 (99%) y el succínico anhídrido –d4 (> 98%) puede contribuir a una pequeña sobrestimación de hasta el 2% (succinyl) o 1% (acetilo) de la nivel4de acilación endógena. Juntos, estas sobrestimaciones ligeras añadir a la dificultad en la cuantificación de sitios con menos del 1% ocupación. Gran abundancia diferencias la completa químicamente péptidos acilados y los péptidos acilados nativo también contribuyen a posibles errores de cuantificación de ocupación del sitio, especialmente para los de péptidos acilados endógena baja27. Un estudio reciente de Weinert et al. 27 halló que abundancia disminuida diferencias entre péptidos acetilado por completo pueden reducir el error de cuantificación27.
Cuantificaciones de la estequiometría se reunieron mediante este protocolo pueden señalar puntos importantes acilación en una hipótesis particular de proteína y forma para experimentos biológicos de seguimiento, tales como mutagénesis sitio-dirigida de algunos sitios de interés. Este protocolo también podría revelar efectos combinados de la acilación baja sitios de estequiometría que podrían ejercer influencias indirectas o sutiles en la estabilidad estructural de proteínas y localizan entornos celulares. Además, aplicación del presente Protocolo para medir la acetilación y succinylation y otras modificaciones de la acilación de lisina posible más allá de acetilación únicamente ofrece conocimientos sobre los efectos de la dinámica de la acilación en proteínas en diferentes condiciones biológicas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el NIH Instituto Nacional de Diabetes y enfermedades NIH- NDIC otorgan DK085610 R24 (PI: E. Verdin). JGM fue apoyado por una beca del NIH T32 (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Los autores reconocen apoyo de NIH compartieron concesión de instrumentación para el sistema TripleTOF 6600 del Instituto Buck (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |