هنا، فإننا نقدم القياس الكمي غير منحازة للبروتين خاصة بالموقع شغل أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن (ستويتشيوميتري) للبروتين الكامل عن طريق تحليل راتيوميتريك الذاتية تعديلات على التعديلات التي أدخلت بعد الكمية أسيليشن الكيميائية استخدام مستقرة أو أملاحه المسماة النظائر. في تركيبة مع حيازة مستقلة عن البيانات الحساسة الكتلي، يتم الحصول على قياسات شغل الموقع دقيقة.
الحث على تعديل بوستترانسلاشونال (PTM) من بقايا يسين البروتين من NƐ-أسيليشن التغييرات الهيكلية التي يمكن أن تنظم بشكل حيوي وظائف البروتين، على سبيل المثال، بتغيير النشاط الأنزيمي أو بوساطة التفاعلات. تحديد كمي دقيق لشغل أسيليشن البروتين الخاصة بالموقع، أو stoichiometry، أمر ضروري لفهم العواقب الوظيفية العالمية ذات المستوى المنخفض ستويتشيوميتري وستويتشيوميتري أسيليشن الرفيع المستوى الفردي ليسين محددة المخلفات. مجموعات أخرى قد أفادت قياس يسين acetylation stoichiometry بمقارنة نسبة نظائر السلائف الببتيد من أسيليشن الطبيعية الذاتية، ووفرة وعرض أسيليشن النظائر التي تحمل علامات خارجية، ثقيلة بعد الكمية أسيتيليشن الكيميائية للبروتينات باستخدام المسمى النظائر المستقرة أنهيدريد الخل. ويصف هذا البروتوكول نهج أمثل يضم العديد من التحسينات، بما في ذلك: (1) زيادة كفاءة أسيليشن الكيميائية، (2) القدرة على قياس البروتين سوكسينيليشن بالإضافة إلى أسيتيليشن، و (3) تحسين دقة الكمية المقرر أن انخفاض تداخلات استخدام جزء أيون الكمي من الحيازة مستقلة عن البيانات (DIA) بدلاً من إشارة أيون السلائف من اقتناء البيانات تعتمد على (DDA). استخدام المناطق ذروة المستخرجة من الأيونات جزء للتحديد الكمي أيضا فريد يتيح التفريق بين ستويتشيوميتري أسيليشن مستوى الموقع من الببتيدات بروتيوليتيك التي تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا يسين، التي ليس من الممكن استخدام السلائف أيون إشارات للقياس الكمي. التصور البيانات في أفق، بيئة البروتيوميات كمية مفتوحة مصدر، يسمح بالتفتيش ملاءمة البيانات واستعراضها. معا، يوفر سير العمل هذا التقدير الكمي غير متحيزة ودقيقة، ودقيقة لشغل البروتين الكامل، التي يمكن أن تكشف وإعطاء الأولوية للمواقع ذات الصلة بيولوجيا أسيلاتيون acetylation و succinylation يسين الخاصة بالموقع.
NƐ-أسيليشن من بقايا يسين البروتين منظم هام لوظيفة البروتين. يسين acetylation وأسيليشنز الأخرى، مثل سوكسينيليشن، مالونيليشن، وجلوتاريليشن، ويعتقد أن تنظيم الأيض، مما يشير إلى خلية، وسائر العمليات الخلوية1،2،3،4 ، ولها آثار في الاضطرابات الأيضية5. وجدت العديد من الدراسات أن التعديلات اشيل يسين تغيرات كبيرة إضعاف-تحت ظروف مختلفة في أنسجة الثدييات وخلية خطوط5،6،،من78 ، وكذلك البكتيريا9،،من1011، ومع ذلك، هذه التغييرات النسبية إضعاف لا ثاقبة نسبة البروتين الكلي تعديل. تغيير الدراسات الإبلاغ عن قياسات لشغل موقع أسيليشن النادرة12،،من1314، على الرغم من الأهمية وحاجة لمثل هذه الدراسات أنها توفر المزيد من التفاصيل من حظيرة النسبي. على سبيل المثال، يمكن تغيير إذ تمثل زيادة شغل موقع من 0.01 إلى 0.1% 1 إلى 10% أو حتى 10 إلى 100%. قياسات دقيقة stoichiometry مطلوبة لتفسير أهمية بيولوجية أسيليشن والتنبؤ بالأثر فيما يتعلق بحجم البروتين الهيكلي، وربما تغييرات وظيفية.
يستخدم الأسلوب السابق واحد التحديد الكمي لشغل موقع الثقيلة النظائر المستقرة العلامات الكيميائية مخلفات يسين غير معدلة تليها الكتلي لقياس النسبة بين الذاتية acetylation “الخفيفة” بالمقارنة مع الخارجية، يسمى كيميائيا “الثقيلة” أسيتيل-يسين استخدام السلائف أيون كثافات12. آخر دراسة أجريت مؤخرا بزهو وآخرون. 13 وصف نهج مماثل لتقييم stoichiometry acetylation يسين أيضا يعمل أسيتيليشن كيميائية كاملة من جميع مخلفات يسين غير معدلة في البروتينات مع النظائر المستقرة التي وصفها، لكنها تستخدم كثافات أيون يفتت مقاسا أجندة الدوحة للتنمية. ناكاياسو وآخرون. 14 تستخدم نهجاً مماثلاً في أجندة الدوحة للتنمية، ولكن بدلاً من ذلك استخدام نسبة أيونات إيمونيوم الخفيفة والثقيلة أسيتيل-يسين للقياس الكمي. القياس الكمي استناداً إلى أيونات يفتت، أيونات إيمونيوم أو تسلسل (MS2)، في معظم الحالات نتج عن تداخلات إشارة أقل مقارنة بمعالجة سليمة الببتيد السلائف أيونات (MS1). ومع ذلك، التحديد الكمي لأيونات جزء من الأطياف MS/MS المولدة بأجندة الدوحة للتنمية يمكن يعانون من نقص أخذ العينات العشوائية، حيث الأيونات السلائف وفرة عالية من المرجح أن يتم اختيارها ل MS/MS، ويؤدي بالتالي، إلى عينة متحيزة وغير مكتملة من أيونات السلائف.
هذه رواية سير العمل4 (الشكل 1) يستخدم نظرياً نظائر مستقرة كيميائية وسم نهج وضعت أصلاً من قبل بايزا et al. 12، لكن سير العمل بعد ذلك يقترن ديا لجمع كل السلائف ووفرة أيون يفتت متعددة عبر وسائل الاكتشاف تتراوح15،16 توفير حسابات stoichiometry دقيقة.
مناطق الذروة من تجزئة الأيونات التي تحتوي على الموقع أسيليشن للفائدة، أو ‘التفريق أيونات يفتت’، وتستخدم للتحديد الكمي لشغل موقع أسيليشن (الشكل 2). أيونات بلغة لا تحتوي على التعديل قيم متطابقة الخفيفة والثقيلة m/z، وتستخدم لتحديد الببتيد ولكن ليس للقياس الكمي. أفق البرمجيات17 يستخدم لاستخراج السلائف وجزء من مناطق الذروة. وجود أيونات يفتت متعددة تحتوي على موقع أسيليشن معين يوفر المرونة إذا تم الكشف عن التدخل في بعض الأيونات جزء. التصور البيانات في أفق يسمح للتفتيش الحرجة من نسب أيون يفتت الخفيفة إلى الثقيلة. بالإضافة إلى تحليل البيانات يدوياً، وضعت مجموعة R مفتوحة مصدر كتب داخليا، ستيوتشيوليزير (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR)،، الذي يستخدم السلائف أيون ويفتت أيون البيانات التي يتم جمعها عن طريق ديا ويوضحها أسيليشن الخاصة بالموقع ستويتشيوميتري من الببتيدات تحتوي على بقايا يسين متعددة، سمة غير ممكن مع السلائف كثافة أيون فقط القياسات4.
كما يوضح هذا البروتوكول استعمال اندوبروتيناسي غلو-ج، التي محددة للانقسام الطرفي ج في بقايا الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك، بدلاً من استخدام التربسين أو مبطلات Arg-C، كما هذا الأخير غالباً ما تولد كبيرة جداً ويحتمل أن تتضاعف أسيلاتيد proteolytic الببتيدات الناتجة عن الانقسام التربسين المحظورة في المخلفات يسين أسيلاتيد. ومددت الكيميائية تسمية الإجراء أيضا تشمل استخدام succinic الخل (الشكل 1)، مما يمكن من التحديد الكمي سوكسينيليشن ستويتشيوميتري سوكسينيليشن. بالإضافة إلى التحسينات في إعداد عينة، تنفيذ تجزئة الببتيد بالاس الهيدروجيني دون اتصال، الأساسية، انخفض عكس-المرحلة (bRP) فصل من الببتيدات كذلك تداخلات الكمي، مما يتيح الالتواء دي أفضل من أسيليشن ستويتشيوميتري في عينات البروتين الكامل. معا، ويتميز هذا الأسلوب ويسلط الضوء على العديد من المزايا: (1) زيادة كفاءة أسيليشن الكيميائية؛ (2) قياس البروتين سوكسينيليشن ستويتشيوميتري بالإضافة إلى أسيتيليشن؛ و (3) التحديد الكمي تحسين الدقة. تحسين التقدير الكمي سبب انخفاض تداخلات في إشارات أيون جزء من ضياء مقارنة بإشارة السلائف أجندة الدوحة للتنمية، فضلا عن تنفيذ تجزئة دون اتصال الببتيد قبل برنامج إعادة هندسة العمليات.
ويوفر هذا البروتوكول الرواية وأسلوب دقيق لقياس acetylation يسين الخاصة بالموقع وشغل سوكسينيليشن التي يمكن تطبيقها على البروتين أكملها. يعتمد هذا الأسلوب على قياس الببتيدات الخفيفة المحلية والخارجية الببتيدات ثقيلة، التي ولدت في المختبر باستخدام الكمية أسيليشن الكيميائية للبروتينات مع الديوتيريوم أنهيدريد الخل-د6 أو سوكسينيك الخل-د4 (الشكل 1). أساليب مماثلة استخدمت وسم النظائر المستقرة من بقايا يسين غير معدلة الأصلي وإجراء القياس الكمي شغل الموقع استناداً إلى أما السلائف أيون فقط12 أو يفتت الأيونات من إدارة شؤون نزع السلاح المقتنيات13،14. هذا البروتوكول ينطبق على العديد من الخطوات أثناء إعداد نموذج لتحسين كفاءة أسيليشن وتمتد العلامات الكيميائية إلى سوكسينيليشن. وتحصل على جمع البيانات باستخدام المقتنيات ديا أيون السلائف ويفتت MS2 كثافات أيون عبر كامل نطاق أسلحة قابلة للكشف، وبالتالي تقليل تداخلات أيون يفتت. التحليل والقياس الكمي عبر الأفق، والبرامج النصية المخصصة لتطويره داخليا يسمح حساب شغل موقع الببتيدات تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا يسين وأسيليشن واحد أو أكثر في موقع واحد.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال مرحلة إعداد عينة من هذا البروتوكول، ينبغي أن تتبع عن كثب. منذ بروتوكول كامل يعتمد على كفاءة تعديل جميع يسين المخلفات الكيميائية، إلا أن هذه الخطوة ذات أهمية قصوى. أو أملاحه تتفاعل مع الأمينات الحرة، ولذلك لا بد من تجنب المحتوية على أمين المخزن المؤقت أو الملوث الجزيئات في البروتين ليساتي. أيضا خلال هذه الخطوة الواحدة أسيليشن الكيميائية، ضمان أن يعدل الرقم الهيدروجيني لخليط رد فعل العودة إلى درجة الحموضة 8 بعد كل من إينكوبيشنز الثلاثة مع كاشف الخل أسيديفيس رد الفعل هذا الخليط، وقد تشكل التفاعلات الجانبية س-أسيليشن. وعلاوة على ذلك، تمييع م 8 المحتوية على اليوريا رد فعل المخلوط إلى حوالي 0.8 م اليوريا قبل الهضم، والتحقق من أن درجة الحموضة داخل النطاق الأمثل مهم لنشاط الأمثل اندوبروتيناسي غلو-C. هو عنصر رئيسي آخر لأن البروتوكول خطوة جمع البيانات وإدخال سير ديا، الذي يتغلب على أية حالات عدم تناسق في البيانات أخذ العينات أجندة الدوحة للتنمية، والتي تسمح للتقدير الكمي على مستوى أيون بلغة MS2. واحد الميزة الرئيسية لمنهجية ضياء هو نقصان التدخلات التي عادة أكثر عرضه وإشكالية عند قياس الإشارات أيون السلائف MS1 (كما اقترح البعض من المنشورات السابقة).
ويمكن إجراء تعديلات عدة على سير العمل عند إعداد نماذج معقدة للغاية. استخدام عدد الكسور التي تجمع بعد تجزئة [هبلك] عكس المرحلة الأساسية-الأس الهيدروجيني دون اتصال يمكن تقليلها إلى أدنى تعقيد العينات المجمعة التي سيتم اكتسابها من خلال السيدة LC/”الإضافة إلى ذلك”، يمكن أن تعد الكروماتوغرافي التدرجات أيضا خلال اقتناء للسماح لأفضل الببتيد الانفصال. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام البروتياز متعددة لهضم العينات إنتاج مجموعة أكبر من الببتيدات ملصوق وزيادة تغطية بقايا يسين البروتين. يمكن إجراء يدير المحاكمة والتحسين باستخدام جيش صرب البوسنة التجارية التي تحتوي على نسب معينة من أسيتيليشن أو سوكسينيليشن.
حد واحد لهذا البروتوكول هو المبالغة شغل موقع يحتمل أن تكون طفيفة نظراً للتعديلات يسين الأخرى، مثل مثلايشن أو أوبيكويتينيشن، إلخ، في نفس الموقع4في عداد المفقودين. تحسب من مناطق ذروة التعديلات اشيل الخفيفة والثقيلة، L/(L+H)، شغل موقع على أساس الافتراض بأن المستوى الإجمالي للتعديل في موقع يسين يتكون من أسيليشن الذاتية فقط ‘الضوء’ (L) وكيميائيا المسمى ‘الثقيلة’ أسيليشن (ح). ومع ذلك، قد تشمل شغل أسيليشن المجموع الفعلي في المواقع في فيفو تعديلات أخرى خارج أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عنها النظائر نقاء الكواشف التي تم شراؤها أنهيدريد الخل-د6 (99 ٪) وسوكسينيك الخل-د4 (> 98 ٪) قد تساهم المبالغة في تقدير صغيرة ليصل إلى 2 في المائة (سوكسينيل) أو 1% (أسيتيل) أسيليشن الذاتية المستوى4. معا، هذه أوفيريستيميشنز طفيفة إضافة إلى صعوبة التحديد الكمي للمواقع مع أقل من 1 ٪ شغل. وفرة كبيرة في الاختلافات بين كاملة كيميائيا الببتيدات أسيلاتيد الببتيدات أسيلاتيد الأصلية كما تسهم وأخطاء القياس الكمي شغل موقع المحتملة، لا سيما بالنسبة أسيلاتيد الذاتية منخفضة الببتيدات27. دراسة حديثة أجراها وينيرت وآخرون. 27 وجدت أن وفرة انخفاض الفروق بين الببتيدات كاملة أسيتيلاتيد الواحدة يمكن أن تقلل من خطأ في التقدير الكمي27.
كوانتيفيكيشنز ستويتشيوميتري التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول يمكن تحديد النقاط الساخنة أسيليشن هامة في فرضيات البروتين ونموذج خاص للتجارب المتابعة البيولوجية، مثل الطفرات موقع الموجه من بعض المواقع للفائدة. هذا البروتوكول يمكن أن تكشف أيضا عن الآثار المجتمعة لمواقع ستويتشيوميتري أسيليشن المنخفضة التي يمكن أن تمارس التأثيرات غير المباشرة أو خفية على الاستقرار الهيكلي البروتين والمترجمة البيئات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، سيتيح تنفيذ هذا البروتوكول لقياس أسيتيليشن وسوكسينيليشن وتعديلات أخرى أسيليشن يسين ممكن تتجاوز acetylation فريد ثاقبة آثار دينامية أسيليشن على البروتينات تحت مختلف الظروف البيولوجية.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها “المعهد الوطني للسكري في المعاهد الوطنية للصحة” والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي المعاهد الوطنية للصحة-نيدك منح R24 DK085610 (PI: Verdin هاء). وأيده ججم زمالة T32 المعاهد الوطنية للصحة (T32 AG000266، PI: J. Campisi). الكتاب الاعتراف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة يشارك منحة الأجهزة لنظام 6600 تريبليتوف في معهد باك (1S10 OD016281، PI: يتعلق جيبسون).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |