Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.
Post-translationale Modifikation (PTM) von Lysin Proteinreste durch NƐ– Acylation führt zu strukturelle Veränderungen, die dynamisch Proteinfunktionen, z. B. durch enzymatische Aktivität ändern oder durch Vermittlung von Interaktionen regulieren können. Genaue Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acylation Belegung oder Stöchiometrie, ist wesentlich für das Verständnis der funktionellen Konsequenzen der globalen Low-Level-Stöchiometrie und einzelne hochrangige Acylation Stöchiometrie von spezifischen Lysin Rückstände. Andere Gruppen haben durch den Vergleich des Verhältnis von Peptid Vorläufer Isotope von endogenen, natürlichen Fülle Acylation Messung von Lysin Acetylierung Stöchiometrie berichtet und exogene, schweren Isotopen-Label Acylation führte ihn nach quantitativen chemischen Acetylierung von Proteinen mit stabilen Isotopen-Label Essigsäureanhydrid. Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz mit einigen Verbesserungen, einschließlich: (1) erhöhte chemische Acylation Effizienz, (2) die Fähigkeit, Protein Succinylation neben Acetylierung zu messen, und (3) verbesserte quantitative Genauigkeit reduzierten Interferenzen mit Fragment Ion Quantifizierung von Daten-unabhängige Akquisitionen (DIA) statt Vorläufer Ionen-Signal vom datenabhängiges Erwerb (DDA). Die Verwendung von extrahierten Peakflächen von Fragment-Ionen für die Quantifizierung ermöglicht auch einzigartig Differenzierung der Standortebene Acylation Stöchiometrie von proteolytischen Peptide enthält mehrere Lysin Rückstände, die nicht mit Vorläufer Ionen möglich Signale für die Quantifizierung. Datenvisualisierung im Skyline, ein open-Source-quantitative Proteomik-Umfeld ermöglicht bequem Daten Inspektion und Überprüfung. Gemeinsam bietet dieses Workflows unvoreingenommene, präzise und genaue Quantifizierung der standortspezifischen Lysin Acetylierung und Succinylation Belegung der eine gesamte Proteom, die offenbaren und biologisch relevante Acylation Websites zu priorisieren.
NƐ– Acylation von Lysin Proteinreste ist ein wichtiger Regulator der Proteinfunktion. Lysin Acetylierung und andere Acylations, wie Succinylation, Malonylation und Glutarylation, werden gedacht, um Stoffwechsel, Zelle und andere zelluläre Prozesse1,2,3,4 zu regulieren , und wirken sich in Stoffwechselstörungen5. Zahlreiche Studien haben ergeben, dass Lysin Acyl Änderungen große Falte-unter verschiedenen Bedingungen in den Säugetier-Geweben Veränderungen und Zell-Linien5,6,7,8 , sowie Bakterien9,10,11, bieten jedoch diese relative Falte Änderungen keine Einblicke in den Anteil des gesamten Proteins geändert. Studien berichten Messungen der Acylation Website Belegung sind knapp12,13,14, trotz der Relevanz und müssen für solche Untersuchungen, da sie mehr Details als relative Falte bieten ändern. Beispielsweise könnte eine 10-divisibel Änderung eine Erhöhung der Website Belegung von 0,01 bis 0,1 %, 1 bis 10 % oder sogar 10 bis 100 % dar. Genaue Stöchiometrie Messungen sind erforderlich, um biologische Bedeutung Acylation interpretieren und Auswirkungen bezüglich der Größe des Proteins strukturelle, vorherzusagen und gegebenenfalls funktionelle Veränderungen.
Eine vorherige Methode zur Website Belegung quantifizieren nutzt schweren stabilen Isotop chemische Kennzeichnung von unveränderten Lysin Rückstände gefolgt von Massenspektrometrie, das Verhältnis zwischen endogenen “Licht” Acetylierung im Vergleich zu den exogenen zu messen, chemisch-mit der Bezeichnung “schwere” Acetyl-Lysin mit Vorläufer Ionen-Intensitäten12. Eine weitere aktuelle Studie von Zhou Et Al. 13 beschrieben einen ähnlichen Ansatz um Lysin Acetylierung Stöchiometrie zu bewerten, die auch eine komplette chemische Acetylierung alle unveränderten Lysin-Reste in Proteinen mit stabilen Isotopen Kennzeichnung eingesetzt, aber verwendet Fragment Ion Intensitäten gemessen DDA. Nakayasu Et Al. 14 verwendet einen ähnlichen Ansatz der DDA, aber stattdessen verwendet das Verhältnis von leichten und schweren Acetyl-Lysin Immonium Ionen zur Quantifizierung. Quantifizierung, basierend auf Fragment-Ionen, Immonium oder Sequenz Ionen (MS2), in den meisten Fällen führt zu weniger Signal Störungen im Vergleich zur Verarbeitung intakt Peptid Vorläufer Ionen (MS1). Jedoch kann Quantifizierung der Fragment-Ionen aus DDA generiert MS/MS Spektren stochastische Probenahme Mängel leiden wo die hohe Fülle Vorläufer Ionen sind eher für MS/MS ausgewählt werden und so zu führen, um eine einseitige und unvollständige Auswahl von Vorläufer-Ionen.
Dieses neuartige Workflow4 (Abbildung 1) nutzt konzeptionell ein stabiles Isotop chemische Kennzeichnung Ansatz ursprünglich von Baeza Et Al. 12, jedoch ist der Workflow anschließend gepaart mit DIA beiden Vorläufer zu sammeln und mehrere Fragment Ion Häufigkeiten über die nachweisbaren Masse reichen15,16 bietet genaue Stöchiometrie Berechnungen.
Peakflächen von fragment Ionen, die die Acylation Website des Interesses enthalten, oder “Unterscheidung zwischen Fragment-Ionen”, zu quantifizieren, Acylation Website Belegung (Abbildung 2) verwendet werden. Fragment-Ionen, die die Änderung nicht enthalten haben identische leichte und schwere m/Z-Werte und dienen zur Identifizierung von Peptid aber nicht zur Quantifizierung. Skyline von Software17 dient zum Vorläufer und Fragment Peakflächen zu extrahieren. Das Vorhandensein von mehreren Fragment-Ionen mit einer bestimmten Acylation Website bietet Flexibilität, wenn Störungen in einigen der Fragment-Ionen erkannt werden. Datenvisualisierung im Skyline erlaubt kritische Prüfung von leicht bis schwer Fragment Ionen-Verhältnisse. Neben der manuellen Datenanalyse war ein Open-Source-R-Paket geschrieben, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), entwickelt, die verwendet der Vorläufer Ionen und Fragment Ion erhobenen Daten durch DIA und quantifiziert, standortspezifische Acylation Stöchiometrie von Peptiden, die mehrere Lysin Rückstände enthalten, ein Feature mit Vorläufer Ionen nur Intensität Messungen4nicht möglich.
Dieses Protokoll zeigt auch den Einsatz von Endoproteinase Glu-C, das ist spezifisch für die C-terminale Spaltung an Glutaminsäure und Asparaginsäure Rückstände, anstelle von Trypsin oder Arg-C Protease, da letztere oft sehr groß erzeugen und potenziell multiplizieren Acylated proteolytischen Peptide aus blockiert Trypsin Spaltung bei Acylated Lysin Rückstände. Die chemische Kennzeichnung Verfahren wurde auch Verwendung von Bernsteinsäure Anhydrid (Abbildung 1), wodurch die Quantifizierung von Succinylation Stöchiometrie Succinylation ausgedehnt. Zusätzlich zu den Verbesserungen, die Probenvorbereitung, die Umsetzung des Peptids Fraktionierung von offline, Basis pH, sank umgekehrt-Phase (bRP) Trennung von Peptiden weitere Quantifizierung Störungen, so dass besser ent-Faltung der Acylation Stöchiometrie in ganze Proteom Proben. Zusammen, diese Methode bietet und hebt mehrere Vorteile: (1) Steigerung der Effizienz der chemischen Acylation; (2) Messung von Protein Succinylation Stöchiometrie neben Acetylierung; und (3) verbesserte Quantifizierung Genauigkeit. Die verbesserte Quantifizierung ist aufgrund der verringerten Eingriffe in Fragment Ionen-Signale von DIA im Vergleich zu DDA Vorläufer Signal sowie die Durchführung von Offline-Peptid Pre Fraktionierung von bRP.
Dieses Protokoll bietet eine neuartige und genaue Methode zur Quantifizierung von standortspezifischen Lysin Acetylierung und Succinylation Personen, die eine gesamte Proteom angewendet werden können. Diese Methode beruht auf der Messung von endogenen leichte Peptide und exogene schwere Peptide, von denen die letztere sind generierte in Vitro mit quantitativen chemischen Acylation von Proteinen mit deuterierte essigsaurem Anhydrid –d6 oder Bernsteinsäure Anhydrid –d4 (Abbildung 1). Ähnliche Methoden verwendet, stabilen Isotopen Kennzeichnung von nativen unveränderten Lysin Rückstände und durchgeführt Website Belegung Quantifizierung basierend auf entweder Vorläufer Ionen nur12 oder Fragment Ionen vom DDA Akquisitionen13,14. Dieses Protokoll gilt mehrere Schritte während der Probenvorbereitung, Acylation Effizienz zu verbessern und erstreckt sich die chemische Bezeichnung, Succinylation. Datenerfassung mit DIA Akquisitionen erhält Vorläufer Ionen und MS2 Fragment Ion Intensitäten über den gesamten nachweisbar Massenbereich, wodurch die Fragment-Ionen Interferenzen. Analyse und Quantifizierung über Skyline und benutzerdefinierte Skripts eigenentwickelte erlauben die Website Belegung Berechnung für Peptide mit mehr als einem Lysin Rückstände und mehr als ein Acylation an einem Standort.
Es gibt mehrere wichtige Schritte während der Vorbereitungsphase Probe dieses Protokolls, die engmaschig überwacht werden sollte. Da das gesamte Protokoll stützt sich auf effiziente chemische Modifikation von alle Lysin-Reste, ist dieser Schritt von größter Bedeutung. Anhydride reagieren mit freien Amine, Amin-haltigen Puffer oder Verunreinigung Moleküle des Proteins lysate vermieden werden müssen. Auch während der chemischen pro Acylation Schritt sicherstellen Sie, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches zurück zu pH 8 nach jeder der drei Inkubationen mit Anhydrid Reagenz angepasst wird, wie diese Reaktion die Mischung säuert, und O-Acylation Nebenreaktionen können sich bilden. Darüber hinaus ist Verdünnung der 8 M Harnstoff-haltige Reaktionsmischung um rund 0,8 M Harnstoff vor der Verdauung und Überprüfung, die der pH-Wert im optimalen Bereich ist wichtig für die optimale Aktivität der Endoproteinase Glu-C. Eine weitere wichtige Komponente unseres Protokolls ist der Daten-Sammlung-Schritt und die Einführung eines DIA-Workflows, die überwindet Inkonsistenzen DDA Daten Probenahme und ermöglicht die Quantifizierung der MS2 Fragment Ionen-Ebene. Ein Hauptvorteil der DIA-Methodik ist der Rückgang der Störungen, die in der Regel viel mehr anfällig und problematisch bei der MS1 Vorläufer Ionen-Signal (wie einige der früheren Publikationen vorgeschlagen haben).
Mehrere Änderungen an den Workflow können erfolgen, wenn hoch komplexe Proben vorbereiten. Die Anzahl der Fraktionen gebündelt nach offline Basic-pH-Wert umgekehrt Phase HPLC Fraktionierung gesenkt werden kann, um die Komplexität der gepoolten Proben zu senken, die auch von LC/MS. darüber hinaus mehr chromatographische Steigungen können erworben werden werden bei verwendet Akquisition, um bessere Peptid-Trennung zu ermöglichen. Alternativ können mehrere Proteasen verdauen Proben zu produzieren eine größere Auswahl an gespalten Peptide und Abdeckung von Lysin Proteinreste zu erhöhen verwendet werden. Probeläufe und Optimierung können mit kommerziellen BSA mit bestimmten Prozentsätzen der Acetylierung oder Succinylation durchgeführt werden.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist potenziell leichte Website Belegung Überschätzung wegen andere Lysin-Modifikationen, wie Methylierung oder Ubiquitination, etc.an den gleichen Standort4vermisst. Berechnet aus der Peakflächen von leichten und schweren Acyl Modifikationen, L/(L+H), ist die Website-Belegung basierend auf der Annahme, dass die Gesamthöhe der Änderung an einem Standort Lysin aus nur endogene “light” Acylation (L besteht) und chemisch mit der Bezeichnung “schwer” Acylation (H). Jedoch kann die tatsächliche Summe Acylation Belegung an einem Standort in Vivo andere Modifikationen über Acetylierung und/oder Succinylation enthalten. Darüber hinaus die gemeldeten isotopischen Reinheit der gekauften Reagenzien essigsaurem Anhydrid –d6 (99 %) und Bernsteinsäure Anhydrid –d4 (> 98 %) kann dazu beitragen, eine kleine Überschätzung von bis zu 2 % (Succinyl) oder 1 % (Acetyl) von der endogene Acylation Stufe4. Diese leichte Überschätzung addieren, die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Standorte mit weniger als 1 % Belegung. Grosse Fülle Unterschiede zwischen der kompletten chemisch Acylated Peptide und die native Acylated Peptide auch zur Website Belegung Quantifizierung Fehlermöglichkeiten, vor allem für die niedrigen endogenen Acylated Peptide27. Eine aktuelle Studie von Weinert Et Al. 27 festgestellt, dass verminderte Fülle Unterschiede zwischen kompletten pro acetyliert Peptide die Quantifizierung Fehler27reduzieren können.
Stöchiometrie Quantifizierungen gesammelt, unter Verwendung dieses Protokolls können genau bestimmen, wichtige Acylation Hotspots in ein bestimmtes Protein und Form Hypothesen für biologische Follow-up-Experimente, wie Site-verwiesene Mutagenese bestimmter Standorte von Interesse. Dieses Protokoll könnte auch kombinierten Effekte der niedrigen Acylation Stöchiometrie Sites aufdecken, die indirekte oder subtile Einflüsse auf strukturelle Proteinstabilität ausüben könnte und zellulären Umgebung lokalisiert. Darüber hinaus böte Durchführung dieses Protokolls, Acetylierung und Succinylation und andere mögliche Lysin Acylation Modifikationen über Acetylierung zu messen einzigartige Einblicke in die dynamische Acylation Auswirkungen auf Proteine unter verschiedenen biologischen Bedingungen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren Krankheiten NIH-NIDDK gewähren R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM wurde unterstützt durch ein Stipendium der NIH T32 (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Die Autoren erkennen Unterstützung durch das NIH geteilt Instrumentierung Zuschuss für das TripleTOF 6600 System am Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |