Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.
A capacidade de detectar e quantificar biomoléculas em soluções complexas sempre foi muito procurada dentro da ciência natural; sendo usado para a detecção de biomarcadores, contaminantes e outras moléculas de interesse. Uma técnica comumente utilizada para este fim é a enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA), onde muitas vezes um anticorpo é direcionado a uma molécula-alvo específico, e um segundo anticorpo marcado é utilizado para a detecção do anticorpo primário, permitindo a quantificação absoluta da biomolécula sob estudo. No entanto, o uso de anticorpos como elementos de reconhecimento limita a robustez do método; como faz a necessidade do uso de moléculas rotuladas. Para superar essas limitações, impressão molecular foi implementado, criação de sites de reconhecimento artificial complementar à molécula de modelo e obsoleting a necessidade do uso de anticorpos para ligação inicial. Além disso, para maior sensibilidade, o anticorpo secundário marcado pode ser substituído por biosensores depender a capacitância para a quantificação da molécula alvo. Neste protocolo, descrevemos um método para rapidamente e sem rótulo detectar e dosar baixo-abundantes biomoléculas (proteínas e vírus) em amostras complexas, com uma sensibilidade que é significativamente melhor do que os sistemas de deteção comumente usados, tais como o ELISA. Isto é tudo mediado por impressão molecular em combinação com um biossensor de capacitância.
A quantificação das biomoléculas é usada em muitos campos diferentes de pesquisa dentro da ciência, empregando métodos como o radioimunoensaio (RIA) ou ELISA1. Alguns desses métodos requerem um rotulado reagente como um radioisótopo ou uma enzima chamada anticorpo/antigénio, o que os torna trabalhosa e demorada com procedimentos complexos2. Além disso, a robustez, seletividade e sensibilidade desses métodos não são suficientes para todas as análises; em particular não são suficientes quando quantidades attogram precisam ser analisado, ao invés de pictograma quantidades3. Para este efeito, biosensores ganharam considerável interesse4,5, em especial em combinação com impressão molecular para uma maior robustez.
Impressão molecular baseia-se na criação de cavidades, polimerização de monômeros funcionais em torno do modelo6, criação de sites de reconhecimento artificial que lembram perfeitamente o modelo7. Esta técnica tem sido usada para diversas aplicações, incluindo sistemas de entrega de droga e separação analítica, mas também como elementos biorecognition em biosensores8,9,10. No entanto, existem ainda algumas dificuldades na concepção de polímeros molecularmente impressos (MIPs) para modelos macromoleculares como proteínas e células de11,12. Devido a isto, muitos pesquisadores concentraram-se na impressão a proteína modelo diretamente sobre um substrato, criando assim uma superfície que será reconhecida pela proteína alvo12. Esta técnica de revestimento de superfície usada para empregar cavidades de reconhecimento por grandes moléculas e montagens, incluindo proteínas é chamada microcontact impressão13,14. O procedimento geral do método depende da polimerização entre duas superfícies – um selo de modelo e um suporte de polímero – sobre a qual o modelo é adsorvido em uma superfície de15,16e trouxe em contato com o superfície tratada com monômero. Por esta maneira, uma película fina de polímero é formada com o apoio através de UV-polimerização. Finalmente, o modelo é removido, deixando para trás a cavidades específicas do modelo na superfície do eletrodo impresso. Este método tem algumas vantagens, incluindo uma perda reduzida atividade da molécula imprimida, quantidades muito pequenas, bem como exigindo de moléculas modelo para a impressão processam16,17. Assim, estas superfícies cost-effective, estáveis, sensíveis e seletivas podem ser criados nas superfícies de sensor, visando a qualquer modelo de escolha do usuário.
O biosensor pode ser usado para a detecção de proteínas simples e macromoléculas muito maiores, incluindo vírus. Um grupo específico de vírus ganhando interesse recente é o bacteriófago, que é um vírus que infecta bactérias. Detecção rápida e sensível de bacteriófagos é importante durante biotecnológicas e biofarmacêutica processos a fim de determinar as infecções de culturas bacterianas com bacteriófagos18. O ensaio biológico mais comumente usado para a deteção do bacteriófago é a dupla camada agar método19, que é trabalhoso e demorado. Várias tentativas foram feitas para desenvolver novas ferramentas de diagnóstico para vírus (incluindo bacteriófagos) como força atômica (AFM) a microscopia20, interferometria21, eletroquímica22e sensor sistema23, 24. um monte de trabalho tem sido focado em biosensores devido a suas vantagens como sendo capaz de medição em tempo real,15,25, altamente sensível e fácil de operar. Um tipo específico de biosensor baseia-se em mudanças na capacitância. Estes biosensores capacitivos são os sensores eletroquímicos que medem mudanças nas propriedades dielétricas quando um analito interage com um elemento de biorecognition na superfície do sensor, causando uma diminuição da capacitância2,4 . Biosensores capacitivos têm sido utilizados para a detecção de vários analitos como antígenos, anticorpos, proteínas e heavy metal íons6,26,,27,28. Estes tipos de biosensores têm muitas vantagens como inerente rapidez, alta sensibilidade, simplicidade, baixo custo, fácil manipulação e medição em tempo real sem rotulagem29.
O método descrito neste documento destina-se a permitir a detecção e quantificação de baixo-abundantes biomoléculas em amostras altamente complexas, sem a necessidade de usar qualquer rotulagem. Em particular, a técnica é mais útil na faixa de atto-picograma de biomoléculas, onde outros instrumentos comercialmente existentes não conseguem dosar com precisão seu alvo.
Quando este método é realizado, existem algumas etapas essenciais que devem ser consideradas ao seguir o protocolo. Um passo crítico é a etapa de limpeza com solução ácida de piranha. Passo 2.1 não deve ser mais de 10 min. A solução de modelo para a etapa 1.4 não deve exceder 0,1 mg/mL, desde que estes valores foram previamente otimizados. Exames titulimétricos cíclica não devem exceder 15 ciclos a fim de obter a espessura ideal. Para etapa 3.1.3, 1,5 µ l é um valor otimizado. Este valor não deve ser mais elevado para este tipo específico de eletrodo. Se o sistema de cura UV tem uma potência de 400 W, a polimerização deve ser executada por um período máximo de 10-15 min. Tão logo o APS (iniciador) é adicionado à solução após TEMED, a etapa subsequente deve ser executada muito rapidamente para evitar a polimerização imediata (passo 3.2.5).
Um dos passos mais importantes é a remoção do carimbo modelo da superfície após a polimerização UV. Se esta etapa não é realizada corretamente, há um risco de que o filme polimérico na superfície do eléctrodo pode ser removido com o carimbo. Portanto, é recomendável para mergulhar o eléctrodo e o carimbo de proteína no topo de uma solução de água após a polimerização e, em seguida, retire o selo muito lentamente e com cuidado a superfície (etapa 3.1.6).
Baseado no modelo utilizado, modificações no tipo e proporção de monômeros usados (monómero funcional e cross-linker) poderão ser avaliadas em termos de geração de maior sensibilidade. Isso deve ser determinado empiricamente. Além disso, a ligação de afinidade da molécula modelo geralmente envolve várias interações diferentes simultaneamente. Portanto, isso pode levar a problemas durante as etapas de regeneração. Se o modelo vinculado não é liberado da superfície corretamente, isso pode influenciar a capacidade de reutilização do eletrodo para posterior análise. Essas afinidades multipontos também podem resultar de ligação através de interações fracas. Em tais sistemas, inespecificas podem ter lugar, que pode influenciar negativamente o a seletividade do sistema16. Estas são comuns e gerais, limitações do método.
Além dessas limitações específicas, existem muitas vantagens significativas do método discutido sobre os métodos existentes. Enquanto RIAs, Elisa e medições fluorométrica são muito sensíveis, eles exigem o uso de material rotulado (modelo ou detector), enquanto o biosensor é completamente rótulo livre. Esses métodos também são mais caros e demorados. Uma abordagem de biosensor permite a síntese rápida, paralelo de MIPs em composições diferentes, o mesmo tempo16. Uma vez que apenas alguns microlitros de solução de monômero é necessária para a preparação, o método é conveniente quando usando caros ou não limitado de monômeros. Além disso, o único eletrodos MIP podem ser usados para aproximadamente 80 análises sem uma diminuição significativa no desempenho, que é significativamente maior do que outros de métodos existentes30. Os métodos existentes também sofrem, em graus variáveis, de baixa sensibilidade e seletividade, enquanto o método descrito permite para detecção e quantificação de moléculas na faixa de pM com alta seletividade.
Devido a relação custo-eficácia, a facilidade de operação do instrumento e a detecção sensível em tempo real em um curto período de tempo em comparação com os métodos existentes, os biosensores são muito promissor ponto-de sistemas de deteção de cuidados sob condições de campo; por exemplo, para monitoramento ambiental e para aplicações em países em desenvolvimento. Em muitas aplicações no diagnóstico da doença, detecção em tempo real, sensível, seletiva e rápida de um biomarcador em uma mistura complexa como o soro é necessário15,25. Aqui, biosensores são superiores aos métodos existentes, em particular, devido à sua sensibilidade e robustez. Especificamente para a detecção de agentes infecciosos, bacteriófagos são recentemente considerados como elemento de biorecognition alternativos para biossensores devido à sua especificidade anfitrião de bactérias33,34,35. Substituição de anticorpos com bacteriófagos é muito promissor, a fim de reduzir o custo e aumentar a estabilidade ainda mais36. Esse sistema também permitirá a detecção e quantificação do fago específico no ambiente e de amostras clínicas. Devido a prevalência de bacteriófagos e sua capacidade de transduce bactérias com genes de resistência aos antibióticos37,38, tal método pode ser valioso para estudar a propagação de bactérias resistentes.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (plataforma de biotecnologia IQ, infecção de medicina, Universidade de Lund) é reconhecido pela execução e fornecer varredura micrografias de elétron. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa Sueco The Conselho Formas (2017-00100) como parte da terceira comum programação iniciativa europeia na chamada de resistência antimicrobiana (JPIAMR) “Dinâmica de transmissão.” Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, interpretação, escrita, preparação do manuscrito, decisão de submeter ou a decisão de publicar o trabalho.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |