Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.
De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van biomoleculen in complexe oplossingen van oudsher zeer gewilde binnen de natuurwetenschappen; wordt gebruikt voor het opsporen van biomarkers, verontreinigingen en andere moleculen van belang. Een veelgebruikte techniek hiervoor is de Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), waar vaak een antilichaam is gericht op een specifieke doelmolecule, en een tweede gelabeld antilichaam wordt gebruikt voor het opsporen van het primaire antilichaam, rekening houdend met de absolute kwantificering van de Biomolecuul bestudeerde. Echter, het gebruik van antilichamen als erkenning elementen beperkt de robuustheid van de methode; net als de noodzaak van het gebruik van gelabelde moleculen. Deze beperkingen wilt opheffen, is moleculaire inprenting geïmplementeerd, maken van kunstmatige erkenning sites ter aanvulling van het sjabloon molecuul en obsoleting de noodzaak van het gebruik van antilichamen voor de eerste binding. Verder, voor nog hogere gevoeligheid, de secundaire gelabeld antilichaam kan worden vervangen door biosensoren afhankelijk van de capaciteit voor de kwantificering van de doelmolecule. In dit protocol beschrijven we een methode om snel en label-gratis detecteren en kwantificeren van lage-overvloedig biomoleculen (eiwitten en virussen) in complexe monsters, met een gevoeligheid die aanzienlijk beter is dan gebruikte detectiesystemen zoals de ELISA. Dit is allemaal gemedieerd door moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.
De kwantificering van biomoleculen wordt gebruikt in veel verschillende onderzoeksgebieden binnen de wetenschap, methodes als de radioimmunoanalyse (RIA) of ELISA1dienst. Sommige van deze methoden vereisen een gelabelde reagens zoals een isotoop of enzyme gelabeld antilichaam/antigeen, waardoor ze arbeidsintensief en tijdrovende met ingewikkelde procedures2. Verder, de robuustheid, de selectiviteit en de gevoeligheid van deze methoden volstaan niet voor alle analyses; in het bijzonder zijn zij niet voldoende als attogram hoeveelheden worden geanalyseerd moeten, in plaats van pictogram hoeveelheden3. Voor dit doel, hebben biosensoren opgedaan belangstelling4,5, in het bijzonder in combinatie met moleculaire inprenting voor een verhoogde robuustheid.
Molecular imprinting, is afhankelijk van de holten maken door functionele monomeren rond de sjabloon6, het creëren van kunstmatige erkenning sites die perfect lijken op de sjabloon7actinemonomeren. Deze techniek is gebruikt voor verschillende toepassingen, met inbegrip van de drug delivery systems en analytische scheiding, maar ook als biorecognition elementen in biosensoren8,9,10. Er zijn echter nog steeds enkele problemen in het ontwerp van moleculair ingeprinte polymeren (MIPs) voor macromoleculaire sjablonen zoals eiwitten en cellen11,12. Wegens dit, hebben vele onderzoekers gericht op Inprenting van het eiwit van de sjabloon rechtstreeks op een substraat, dus het creëren van een oppervlak dat zal worden herkend door de doelgroep eiwit12. Deze oppervlaktecoating techniek die gebruikt wordt voor de toepassing van erkenning Holten voor grote moleculen en verzamelingen met inbegrip van eiwitten heet microcontact inprenting13,14. De algemene procedure voor de methode hangt af van de polymerisatie tussen twee oppervlakken – een stempel van de sjabloon en de ondersteuning van een polymeer – op grond waarvan de sjabloon is geadsorbeerd op één oppervlak15,16, en bracht in contact met de monomeer-behandelde oppervlak. Door op deze manier wordt een dunne polymeerfolie gevormd op de steun via UV-polymerisatie. Tot slot, de sjabloon wordt verwijderd, de specifieke Holten sjabloon aan het oppervlak van de ingeprinte elektrode achterlaat. Deze methode heeft een aantal voordelen, waaronder het verlies van een verminderde activiteit van de ingeprinte molecule, ook als die zeer kleine hoeveelheden van moleculen van de sjabloon voor de inprenting verwerken16,17. Dus, deze kosteneffectieve, stabiel, gevoelige en selectieve oppervlakken kunnen worden gemaakt op de oppervlakken van de sensor, gericht op een sjabloon voor de keuze van de gebruiker.
De biosensor kan worden gebruikt voor de detectie van enkele eiwitten en veel grotere biomacromoleculen, met inbegrip van virussen. Een specifieke groep van virussen die recente belangstelling is de bacteriofaag, die is een virus dat bacteriën infecteert. Snelle en gevoelige detectie van bacteriofagen is belangrijk tijdens de biotechnologische en biofarmaceutische processen om te bepalen van de infecties van bacteriële culturen met bacteriofagen18. De meest gebruikte biologische bepaling voor de detectie van de bacteriofaag is de dubbellaags agar methode19, dat is moeizaam en tijdrovend. Verschillende pogingen zijn gedaan om de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor virussen (bacteriofagen inclusief) zoals atomaire kracht microscopie (AFM)20, interferometrie21, elektrochemie22en sensor systeem23, 24. een heleboel werk is gericht geweest op biosensoren vanwege hun voordelen als zijnde geschikt voor real-time meting15,25, eenvoudig te bedienen en zeer gevoelig. Een bepaald soort biosensor is gebaseerd op veranderingen in capaciteit. Deze capacitieve biosensoren zijn de elektrochemische sensoren die meten van veranderingen in de diëlektrische eigenschappen wanneer een analyt met een biorecognition-element op het sensoroppervlak communiceert, waardoor een vermindering van de capaciteit2,4 . Capacitieve biosensoren zijn gebruikt voor de detectie van verschillende analyten zoals antigenen, antilichamen, proteïnen en zware metaal ionen6,26,27,28. Deze types van biosensoren hebben veel voordelen zoals inherente snelheid, hoge gevoeligheid, eenvoud, lage kosten, gemakkelijke manipulatie en real-time meting zonder etikettering van29.
De hier beschreven methode is gericht op het inschakelen van de opsporing en kwantificering van lage-overvloedig biomoleculen in zeer complexe monsters, zonder de noodzaak van het gebruik van elke labeling. In het bijzonder, is de techniek vooral handig in het bereik van atto-picogram van biomoleculen, waar andere commercieel bestaande instrumenten niet hun doel nauwkeurig te kwantificeren.
Wanneer deze methode wordt uitgevoerd, zijn er enkele essentiële stappen die moeten worden beschouwd, terwijl het volgens het protocol. Een kritieke stap is de schoonmaak stap met zure piranha-oplossing. Stap 2.1 mag niet meer dan 10 min. De oplossing van de sjabloon voor stap 1.4 mag niet meer dan 0,1 mg/mL, aangezien deze waarden eerder zijn geoptimaliseerd. Cyclische voltametric scans mag niet hoger zijn dan 15 cycli met het oog op de optimale dikte. Voor stap 3.1.3 is 1.5 µL een geoptimaliseerde waarde. Deze waarde mag niet hoger voor dit specifieke type van elektrode. Als de UV uitharden systeem een vermogen van 400 W heeft, dan is de polymerisatie moet worden uitgevoerd voor een maximum van 10-15 min. Zodra de APS (initiatiefnemer) wordt toegevoegd aan de oplossing na TEMED, moet de volgende stap zeer snel worden uitgevoerd om te voorkomen dat onmiddellijke polymerisatie (stap 3.2.5).
Een van de belangrijkste stappen is de opruiming van de stempel van de sjabloon van het oppervlak na UV polymerisatie. Als deze stap is niet goed uitgevoerd, bestaat het risico dat de polymere film op het oppervlak van de elektrode kan worden verwijderd met de stempel. Daarom is het aanbevolen om de elektrode en de eiwit-stempel op de top in een oplossing van water onderdompelen na de polymerisatie en deze vervolgens verwijdert de stempel zeer langzaam en zorgvuldig van het oppervlak (stap 3.1.6).
Gebaseerd op de sjabloon gebruikt, kunnen wijzigingen in het type en de verhouding van monomeren gebruikt (functionele monomeer en cross-linker) worden beoordeeld in termen van het genereren van hogere gevoeligheid. Dit moet empirisch worden bepaald. Verder, de affiniteit binding van het sjabloon molecuul meestal gaat om verscheidene verschillende interacties gelijktijdig. Daarom kan dit tot problemen leiden tijdens de regeneratie stappen. Als de afhankelijke sjabloon niet wordt vrijgegeven van het oppervlak goed, kan dit invloed hebben op de herbruikbaarheid van de elektrode voor verdere analyse. Deze multipoint affiniteiten kunnen ook voortvloeien uit bindende via zwakkere interacties. In dergelijke systemen, kan niet-specifieke binding plaatsvinden, die de selectiviteit van het systeem16nadelig kan beïnvloeden. Dit zijn de algemene en algemeen, beperkingen van de methode.
Naast deze specifieke beperkingen zijn er vele aanzienlijke voordelen van de besproken methode ten opzichte van bestaande methoden. Terwijl RIAs, ELISAs en fluorimetrische metingen zeer gevoelig zijn, vereisen ze het gebruik van gelabelde materiaal (sjabloon of detector), terwijl de biosensor is volledig etiket-gratis. Deze methoden zijn ook duurder en tijdrovender. Een biosensor aanpak zorgt voor snelle, parallelle synthese van MIPs in verschillende composities op de dezelfde tijd-16. Aangezien slechts een paar microliters van monomeer oplossing is vereist voor de voorbereiding, is de methode handig bij het gebruik van dure of anderszins beperkt monomeren. Verdere, één MIP elektroden kunnen worden gebruikt voor ongeveer 80 analyses zonder een significante afname in de prestaties, die aanzienlijk hoger is dan andere bestaande methoden30. Bestaande methoden ook lijden, in verschillende gradaties, van lage gevoeligheid en selectiviteit, terwijl de beschreven methode voor de detectie en kwantificering van moleculen in het pM-bereik met hoge selectiviteit zorgt.
Als gevolg van de kosten-batenverhouding, het gemak van de exploitatie van het instrument, en de real-time gevoelige detectie in een korte tijd in vergelijking met bestaande methoden, de biosensoren zijn zeer veelbelovende punt-van zorg detectiesystemen onder veldomstandigheden; bijvoorbeeldvoor milieumonitoring en toepassingen in ontwikkelingslanden. In vele toepassingen in de diagnose van de ziekte is real-time, gevoelige, selectieve en snelle detectie van een biomarker in een complex mengsel zoals serum vereist15,25. Hier, zijn biosensoren superieur aan bestaande methoden, met name als gevolg van hun degelijkheid en gevoeligheid. Specifiek voor de opsporing van infectieuze agentia, zijn bacteriofagen onlangs beschouwd als alternatieve biorecognition element voor biosensoren als gevolg van hun gastheer bacteriën specificiteit33,34,35. Vervanging van antilichamen met bacteriofagen is veelbelovend om te verminderen de kosten en verhogen de stabiliteit nog36. Een dergelijk systeem zal ook toestaan voor de detectie en kwantificering van specifieke bacteriofagen in het milieu en van klinische monsters. Vanwege de prevalentie van bacteriofagen, en hun vermogen om de transduce van bacteriën met resistentie tegen antibiotica genen37,38, kan een dergelijke methode er waardevolle bestuderen van de verspreiding van resistente bacteriële.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (IQ Biotechnologie Platform, infectie geneeskunde, Lund University) is erkend voor het uitvoeren en scanning electron microfoto. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Zweedse onderzoek Raad Formas (2017-00100) als onderdeel van het Europese derde gezamenlijke programmering initiatief inzake antimicrobiële resistentie (JPIAMR) oproep “Transmissie Dynamics.” De financiers had geen rol in de studie ontwerp, interpretatie, schrijven, voorbereiding van het manuscript, besluit indienen, of besluit te publiceren van het werk.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |