نقدم هنا، بروتوكولا للكشف والتحديد الكمي لجزيئات منخفضة وفيرة في حلول معقدة باستخدام الجزيئية ولﻷخذ بالاقتران مع بيوسينسور سعة.
القدرة على الكشف عن وقوانتيتاتي الجزيئات الحيوية في الحلول المعقدة على الدوام رواجا عاليا في العلوم الطبيعية؛ وتستخدم للكشف عن المؤشرات الحيوية، والملوثات، والجزيئات الأخرى ذات الاهتمام. تقنية تستخدم عادة لهذا الغرض هو المرتبط بالانزيم الممتز الإنزيم (ELISA)، جسم واحد غالباً ما تتجه نحو جزيء مستهدفة محددة، حيث جسم مسمى ثاني يستخدم للكشف عن الأجسام المضادة الأولية، مما يسمح تقدير حجم المطلقة بيوموليكولي قيد الدراسة. ومع ذلك، يحد من استخدام الأجسام المضادة كعناصر الاعتراف بمتانة الأسلوب؛ لا الحاجة لاستخدام المسمى الجزيئات. للتغلب على هذه القيود، نفذت الطباعة الجزيئية، إنشاء مواقع الاعتراف اصطناعية مكملة لجزيء القالب ومن خلالها بضرورة استخدام الأجسام المضادة للربط الأولى. علاوة على ذلك، لحساسية أكبر، جسم المسمى ثانوية يمكن الاستعاضة عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تعتمد على السعة للتحديد الكمي للجزيء المستهدف. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة سريعة وخالية من تسمية كشف وقوانتيتاتي الجزيئات الحيوية المنخفضة وفيرة (البروتينات والفيروسات) في العينات المعقدة، مع حساسية التي أفضل بكثير من أنظمة الكشف عن شائعة الاستخدام مثل ELISA. هذا هو كل ما بوساطة الطباعة الجزيئية في تركيبة مع بيوسينسور سعة.
ويستخدم التقدير الكمي للجزيئات الحيوية في العديد من المجالات البحثية المختلفة في العلوم، واستخدام أساليب مثل radioimmunoassay (RIA) أو أليسا1. وتتطلب بعض هذه الأساليب المسمى كاشف مثل النظائر المشعة أو الإنزيم المسمى جسم/مستضد، مما يجعلها ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً مع الإجراءات المعقدة2. علاوة على ذلك، متانة، والانتقائية، والحساسية من هذه الأساليب لا تكفي لجميع التحليلات؛ لا سيما أنها ليست كافية عند كميات أتوجرام بحاجة إلى تحليل، بدلاً من الرسم التخطيطي كميات3. لهذا الغرض، اكتسبت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية اهتماما كبيرا4،5، وبخاصة في تركيبة مع طابعة الجزيئية لزيادة متانة.
الطباعة الجزيئية تعتمد على خلق تجاويف مبلمرة مونومرات الفنية حول قالب6، إنشاء مواقع الاعتراف الاصطناعية التي تشبه تماما في قالب7. وقد استخدم هذا الأسلوب للعديد من التطبيقات، بما في ذلك نظم إيصال المخدرات والفصل التحليلي، ولكن أيضا كعناصر بيوريكوجنيشن في أجهزة استشعار العوامل البيولوجية8،،من910. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض الصعوبات في تصميم مطبوع جزيئيا البوليمرات (MIPs) لقوالب الجزيئات مثل البروتينات والخلايا11،12. ونتيجة لهذا، ركزت العديد من الباحثين على ولﻷخذ البروتين القالب مباشرة على الركازة، وبالتالي إنشاء سطح سوف يتم التعرف عليه بواسطة البروتين الهدف12. وتسمى هذه التقنية طلاء السطح المستخدمة لتوظيف تجاويف الاعتراف للجزيئات الكبيرة والجمعيات بما في ذلك البروتينات ميكروكونتاكت ولﻷخذ13،14. الإجراءات العامة للأسلوب يعتمد على البلمرة بين الأسطح اثنين-طابع قالب ودعم بوليمر-التي تمتز على السطح15،واحد16هو القالب، وأحضر في اتصال مع مونومر المعالجة السطحية. بهذه الطريقة، يتم تشكيل فيلم بوليمر رقيقة على الدعم عن طريق الأشعة فوق البنفسجية–البلمرة. وأخيراً، تتم إزالة القالب، تاركين وراءهم تجاويف القالب محددة على سطح القطب مطبوع. هذا الأسلوب له بعض المزايا بما في ذلك خسارة انخفاض نشاط في جزيء مطبوع، عملية، فضلا عن أنها تتطلب كميات صغيرة جداً من جزيئات قالب للطباعة16،17. وهكذا، يمكن أن تنشأ هذه الأسطح الفعالة من حيث التكلفة، ومستقرة وحساسة، وانتقائية على السطوح الاستشعار، استهداف أي قالب من اختيار المستخدم.
يمكن استخدامها في بيوسينسور للكشف عن البروتينات وحيدة وبيوماكروموليكوليس أكبر بكثير، بما في ذلك الفيروسات. مجموعة محددة من الفيروسات اكتساب الفائدة الأخيرة هو عاثية، وهو فيروس الذي يصيب البكتيريا. المهم الكشف السريع وحساسة من باكتيريوفاجيس خلال البيوتكنولوجية والعمليات الصيدلانية البيولوجية من أجل تحديد حالات العدوى البكتيرية الثقافات مع باكتيريوفاجيس18. المقايسة البيولوجية الأكثر استخداماً للكشف عن عاثية هو أسلوب طبقة مزدوجة أجار19، شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. بذلت عدة محاولات لتطوير أدوات تشخيص الرواية للفيروسات (بما في ذلك باكتيريوفاجيس) مثل القوة الذرية مجهرية (فؤاد)20وقياس التداخل21، كهربية22واستشعار النظام23، 24-وركزت الكثير من العمل على أجهزة استشعار العوامل البيولوجية نظراً لمزاياها أنها سهلة التشغيل وحساسة للغاية، وقادرة على قياس الوقت الحقيقي15،25. يستند نوع معين من بيوسينسور إلى التغيرات في السعة. هذه السعة من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية بقياس التغيرات في خصائص العزل الكهربائي عند أكثر يتفاعل مع عنصر بيوريكوجنيشن على سطح جهاز الاستشعار، مما تسبب في حدوث انخفاض في السعة2،4 . وقد استخدمت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية بالسعة للكشف عن مختلف التحاليل مثل المستضدات والأجسام المضادة، والبروتينات والمعادن الثقيلة أيونات6،26،،من2728. هذه الأنواع من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية لها العديد من المزايا مثل السرعة المتأصلة وحساسية عالية، والبساطة، والتلاعب منخفضة التكلفة وسهلة والقياس في الوقت الحقيقي دون وسم29.
الأسلوب الموصوفة في هذه الوثيقة تهدف إلى تمكين الكشف والتحديد الكمي للجزيئات الحيوية المنخفضة وفيرة في عينات معقدة للغاية، دون الحاجة إلى استخدام أي تسمية. على وجه الخصوص، الأسلوب الأكثر فائدة في مجموعة حلول أتو من الجزيئات الحيوية، حيث فشل غيرها من الصكوك القائمة تجارياً لدقة كوانتيتاتي هدفهم.
عندما ينفذ هذا الأسلوب، وهناك بعض الخطوات الهامة التي يجب مراعاتها في حين يتبع البروتوكول. خطوة حاسمة واحدة هو خطوة التنظيف مع الحل البيرانا الحمضية. لا يجب أن تكون الخطوة 2، 1 أكثر من 10 دقيقة. يجب إلا يتجاوز الحل قالب الخطوة 1.4 0.1 مغ/مل، حيث يكون قد تم تحسين هذه القيم مسبقاً. فحص دوري فولتاميتريك يجب إلا يتجاوز 15 دورات من أجل الحصول على سمك الأمثل. لخطوة 3.1.3، ميليلتر 1.5 القيمة أمثل. يجب أن لا تكون هذه القيمة أعلى بالنسبة لهذا النوع المحدد من القطب. إذا كان علاج نظام الأشعة فوق البنفسجية قوة 400 واط، فلابد البلمرة بحد أقصى 10-15 دقيقة. حالما يتم إضافة وكالة الأنباء الجزائرية (البادئ) إلى الحل بعد تيميد، الخطوة التالية يجب أن يتم بسرعة كبيرة لتجنب البلمرة الفوري (الخطوة 3.2.5).
إحدى الخطوات الأكثر أهمية هو إزالة الطابع القالب من على سطح الأرض بعد البلمرة الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، هناك خطر أن الفيلم البوليمرية على سطح القطب قد تكون إزالتها بالختم. لذلك، من المستحسن أن تزج مسرى وختم البروتين على القمة في التوصل إلى حل للمياه بعد البلمرة، ثم إزالة الطابع ببطء شديد وعناية من على سطح الأرض (الخطوة 3.1.6).
استناداً إلى القالب المستخدم، يمكن تقييم التعديلات في نوع ونسبة المركبات الكيماوية المستخدمة (مونومر الوظيفية وكروسلينكير) من حيث توليد حساسية أعلى. وهذا يجب أن يحدد تجريبيا. علاوة على ذلك، ملزمة تقارب جزيء القالب عادة ما ينطوي على العديد من التفاعلات المختلفة في نفس الوقت. لذلك، قد يؤدي هذا إلى مشاكل أثناء خطوات التجديد. إذا لم يتم تحرير القالب منضم من على سطح الأرض بشكل صحيح، قد يؤثر هذا إعادة استخدام القطب لمزيد من التحليل. قد يؤدي أيضا إلى هذه الانتماءات متعددة من الربط عن طريق التفاعلات الضعيفة. في مثل هذه النظم، قد يستغرق الربط غير محددة المكان، التي يمكن أن تؤثر سلبا على القدرة الانتقائية ل النظام16. وهذه هي القيود المشتركة والعامة، للأسلوب.
وبصرف النظر عن هذه القيود المحددة، هناك العديد من المزايا الهامة طريقة بحث أكثر الأساليب القائمة. حين اتفاقات التكامل الإقليمي، والساس، والقياسات فلوروميتريك حساسة للغاية، فإنها تتطلب استخدام المواد المسمى (قالب أو كاشف)، في حين بيوسينسور تماما تسمية خالية. هذه الأساليب أيضا أكثر تكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. يسمح نهج بيوسينسور للتوليف السريع، موازية لخطط تنفيذ البعثات في التراكيب المختلفة في الوقت نفسه16. منذ فقط بضعة ميكروليتيرس من مونومر الحل مطلوب لإعداد، الأسلوب مناسب عند استخدام مونومرات محدودة باهظة الثمن أو غير ذلك. علاوة على ذلك، واحد أقطاب MIP يمكن استخدامها لحوالي 80 تحليلات دون حدوث انخفاض كبير في الأداء، وأعلى بكثير من غيرها الأساليب القائمة30. الأساليب القائمة تعاني أيضا، بدرجات متفاوتة، من حساسية منخفضة والانتقائية، بينما وصف الأسلوب يسمح للكشف والتحديد الكمي للجزيئات في حدود الساعة بانتقائية عالية.
بسبب الفعالية من حيث التكلفة، سهولة التشغيل في الصك، والكشف عن حساسية في الوقت الحقيقي في وقت قصير مقارنة بالأساليب القائمة، أجهزة استشعار العوامل البيولوجية جداً واعدة نقطة من رعاية نظم الكشف عن الظروف الميدانية؛ مثلاً، لرصد البيئة والتطبيقات في البلدان النامية. في العديد من التطبيقات في تشخيص المرض، هو الكشف في الوقت الحقيقي، والحساسية وانتقائية، والسريع من العلامات البيولوجية في خليط معقد مثل المصل المطلوبة15،25. هنا، متفوقة على الأساليب القائمة، على وجه الخصوص، نظراً لمتانة وحساسية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية. خصيصا للكشف عن العوامل المعدية، تعتبر bacteriophages مؤخرا كعنصر بيوريكوجنيتيون بديلة لأجهزة استشعار العوامل البيولوجية بسبب ما المضيف خصوصية البكتيريا33،،من3435. استبدال الأجسام المضادة مع bacteriophages واعدة جداً من أجل الحد من التكاليف وزيادة الاستقرار المزيد حتى36. كما سيسمح هذا نظام للكشف والتحديد الكمي فاجيس محددة في البيئة ومن العينات السريرية. نظراً لانتشار باكتيريوفاجيس، وقدرتها على ترانسدوسي البكتيريا مع جينات مقاومة المضادات الحيوية37،38، قد يكون من المفيد دراسة انتشار البكتيريا المقاومة مثل هذا أسلوب.
The authors have nothing to disclose.
ماريا بومغارتن (منصة التكنولوجيا الأحيائية الذكاء، والعدوى الطب، جامعة لوند) المسلم لأداء وتوفير المسح الإلكترون ميكروجرافس. وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من Formas مجلس الأبحاث السويدية (2017-00100) كجزء من “الأوروبية الثالثة برمجة المبادرة المشتركة” المتعلقة بمقاومة مضادات الميكروبات (جبيامر) مكالمة “ديناميات انتقال”. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة، وتفسير، والكتابة، إعداد المخطوط، قرار بتقديم، أو قرار لنشر الأعمال.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |