Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification des molécules abondantes faibles dans des solutions complexes en utilisant moléculaire en combinaison avec un biocapteur capacité d’impression.
La capacité à détecter et à quantifier les biomolécules dans des solutions complexes a toujours été très prisée dans les sciences naturelles ; utilisé pour la détection des biomarqueurs, de contaminants et d’autres molécules d’intérêt. Une technique souvent utilisée à cette fin est l’Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), où souvent un anticorps est dirigé vers une molécule cible spécifique, et un second anticorps marqué est utilisé pour la détection de l’anticorps primaire, permettant la quantification absolue de la biomolécule sous étude. Toutefois, l’utilisation des anticorps en tant qu’éléments de reconnaissance limite la robustesse de la méthode ; comme le fait de la nécessité d’utiliser des molécules marquées. Pour surmonter ces limites, empreinte moléculaire a été implémenté, création de sites de reconnaissance artificiel complémentaire à la molécule modèle et obsolète la nécessité d’utiliser des anticorps pour la liaison initiale. En outre, pour une sensibilité encore plus élevée, l’anticorps secondaire marqué peut être remplacé par biocapteurs en s’appuyant sur la capacité pour la quantification de la molécule cible. Dans le présent protocole, on décrit une méthode pour rapidement et sans étiquette détecter et quantifier la basse-abondant biomolécules (protéines et virus) dans des échantillons complexes, avec une sensibilité qui est nettement mieux que les systèmes de détection couramment utilisés comme l’ELISA. C’est tous médiée par l’empreinte moléculaire en combinaison avec un biocapteur capacitance.
La quantification des biomolécules est utilisée dans de nombreux domaines de recherche différents dans la science, en employant des méthodes telles que le dosage radio-immunologique (RIA) ou ELISA1. Certaines de ces méthodes nécessitent une étiquette réactif comme un radio-isotope ou enzyme marqué anticorps/antigène, ce qui les rend fastidieuse et chronophage avec des procédures complexes2. De plus, la robustesse, la sélectivité et la sensibilité de ces méthodes ne sont pas suffisantes pour toutes les analyses ; en particulier, ils ne sont pas suffisantes quand attogram quantités doivent être analysées, plutôt que de pictogramme quantités3. À cette fin, biocapteurs ont acquis un intérêt considérable4,5, en particulier en combinaison avec l’empreinte moléculaire pour une robustesse accrue.
L’empreinte moléculaire repose sur la création de cavités par polymérisation de monomères fonctionnels autour du modèle6, création de sites de reconnaissance artificielles qui ressemblent parfaitement le modèle7. Cette technique a été utilisée pour plusieurs applications, y compris les systèmes de livraison de médicaments et de séparation analytique, mais aussi comme éléments de biocapteurs8,9,10bioreconnaissance. Cependant, il y a encore quelques difficultés dans la conception des polymères (MIPs) pour les modèles macromoléculaires comme protéines et cellules11,12. Pour cette raison, de nombreux chercheurs ont porté imprégnation de la protéine modèle directement sur un substrat, créant ainsi une surface qui sera reconnue par la protéine de cible12. Cette technique de revêtement de surface utilisée pour l’emploi des cavités de reconnaissance pour les grosses molécules et ensembles comprenant des protéines est appelée par microcontact impression13,14. La procédure générale de la méthode dépend de la polymérisation entre deux surfaces – un timbre de modèle et d’un support de polymère – sur laquelle le modèle est adsorbé sur une surface de15,16et mis en contact avec le surface traitée monomère. De cette façon, un film de polymère mince est formé sur le support par UV-polymérisation. Enfin, le modèle est enlevé, laissant derrière lui des cavités de modèle spécifique à la surface de l’électrode imprimée. Cette méthode présente certains avantages, notamment une perte de l’activité réduite de la molécule d’imprimés, ainsi comme exigeant de très petites quantités de molécules de modèle pour l’impression de traitent16,17. Ainsi, ces surfaces rentables, stables, sensibles et sélectifs peuvent être créés sur les surfaces de capteur, axée sur un modèle de choix de l’utilisateur.
Le biocapteur peut être utilisé pour la détection des protéines simples et beaucoup plus grande biomacromolecules, y compris les virus. Un groupe spécifique de virus récent intérêt est le bactériophage, qui est un virus qui infecte les bactéries. Une détection rapide et sensible des bactériophages est importante au cours de biotechnologie et biopharmaceutique processus afin de déterminer les infections de cultures bactériennes avec bactériophages18. Le dosage biologique plus couramment utilisé pour la détection de bactériophage la double couche de gélose méthode19, qui est laborieux et fastidieux. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer de nouveaux outils de diagnostic pour les virus (y compris les bactériophages) comme force atomique (AFM) la microscopie20, interférométrie21, électrochimie22et capteur système23, 24. beaucoup de travail a été axé sur les biocapteurs en raison de leurs avantages comme étant capable de mesure en temps réel15,25, très sensible et facile à utiliser. Un certain type de biocapteur est basé sur les changements dans la capacité. Ces biocapteurs capacitifs sont les capteurs électrochimiques qui mesurent les changements dans les propriétés diélectriques lorsqu’un analyte interagit avec un élément de bioreconnaissance sur la surface du capteur, provoquant une diminution de la capacité2,4 . Capacitifs biocapteurs ont été utilisés pour la détection des différents analytes comme antigènes, anticorps, protéines et des ions de métaux lourds6,26,27,28. Ces types de biocapteurs présentent de nombreux avantages comme la rapidité inhérente, haute sensibilité, simplicité, coût bas, facile de manipulation et mesure en temps réel sans étiquetage29.
La méthode décrite ici vise à permettre la détection et la quantification des biomolécules peu abondantes dans des échantillons très complexes, sans avoir besoin d’utiliser n’importe quel étiquetage. En particulier, la technique est très utile dans la gamme atto-picogramme de biomolécules, où autres instruments existants dans le commerce ne parviennent pas à doser avec précision leur cible.
Lorsque cette méthode est effectuée, il y a certaines étapes critiques qui doivent être considérés en suivant le protocole. Une étape critique est l’étape de nettoyage avec une solution acide de piranha. Étape 2.1 ne doit pas être plus de 10 min. La solution de modèle pour l’étape 1.4 ne doit pas dépasser 0,1 mg/mL, étant donné que ces valeurs ont été optimisées précédemment. Analyses voltamétriques cyclique ne doivent pas dépasser 15 cycles afin d’obtenir l’épaisseur optimale. Pour l’étape 3.1.3, 1,5 µL est une valeur optimisée. Cette valeur ne doit pas être plus élevée pour ce type spécifique d’électrode. Si le UV système de polymérisation, d’une puissance de 400 W, puis la polymérisation doit être effectuée pour un maximum de 10-15 min. Dès que l’APS (initiateur) est ajouté à la solution, après le TEMED, l’étape suivante doit être effectuée très rapidement pour éviter une polymérisation immédiate (étape 3.2.5).
Une des étapes plus critiques est la suppression du timbre de la surface du modèle après polymérisation UV. Si cette étape n’est pas correctement effectuée, il y a un risque que le film polymère sur la surface de l’électrode peut être enlevé avec du cachet. Par conséquent, il est recommandé de plonger l’électrode et le timbre de protéines sur le dessus dans une solution d’eau après la polymérisation, puis retirez le timbre très lentement et avec précaution la surface (étape 3.1.6).
Basé sur le modèle utilisé, modifications du type et de la proportion de monomères utilisés (monomère fonctionnel et réticulant) peuvent être évaluées en termes de génération d’une sensibilité plus élevée. Elle doit être déterminée empiriquement. En outre, l’affinité de la molécule modèle généralement implique plusieurs interactions différentes simultanément. Par conséquent, cela peut conduire à des problèmes au cours des étapes de la régénération. Si le modèle lié n’est pas libéré de la surface correctement, cela peut influer sur la réutilisation de l’électrode pour une analyse ultérieure. Ces affinités multipoints peuvent aussi résulter d’une liaison via des interactions faibles. Dans de tels systèmes, non-spécifiques peut avoir lieu, qui peut influencer négativement la sélectivité du système16. Voici les limites communes et générales, de la méthode.
En dehors de ces limites spécifiques, il y a plusieurs avantages significatifs de la méthode discuté sur les méthodes existantes. Tandis que RIA, ELISA et mesures fluorimétrique sont très sensibles, elles nécessitent l’utilisation de matériel marqué (modèle ou détecteur), tandis que le biocapteur est complètement étiquette exempt. Ces méthodes sont également plus long et coûteux. Une approche de biocapteurs permet une synthèse rapide, en parallèle de MIPs dans des compositions différentes à la même heure16. Puisque seulement quelques microlitres de la solution de monomère est nécessaire pour la préparation, la méthode est pratique lorsque vous utilisez des monomères limitées chers ou autres. En outre, seul MIP électrodes peuvent être utilisées pour environ 80 analyses sans une baisse significative de la performance, qui est nettement supérieure aux autres actuelle des méthodes30. Méthodes existantes souffrent aussi, à des degrés divers de faible sensibilité et sélectivité, tandis que la méthode décrite permet pour la détection et la quantification des molécules dans la gamme MP à haute sélectivité.
En raison de la rentabilité, la facilité de fonctionnement de l’instrument et la sensibilité de détection en temps réel en peu de temps par rapport aux méthodes existantes, les biocapteurs sont très prometteuses point de systèmes de détection de soins dans des conditions de champ ; par exemple, pour la surveillance de l’environnement et pour des applications dans les pays en développement. Dans de nombreuses applications dans le diagnostic des maladies, une détection en temps réel, sensible, sélective et rapide d’un biomarqueur dans un mélange complexe comme le sérum est obligatoire,15,25. Ici, les biocapteurs sont supérieures aux méthodes existantes, en particulier, en raison de leur robustesse et leur sensibilité. Spécifiquement pour la détection d’agents infectieux, les bactériophages sont récemment considérés comme élément de rechange bioreconnaissance pour les biocapteurs à cause de leur hôte bactéries spécificité33,34,35. Remplacement des anticorps avec des bactériophages est très prometteur pour réduire les coûts et augmenter la stabilité encore36. Un tel système permettra également la détection et la quantification des phages spécifiques dans l’environnement et des échantillons cliniques. En raison de la prévalence des bactériophages et leur capacité à transmettre des bactéries avec des gènes de résistance aux antibiotiques37,38, une telle méthode peut être précieuse étudie la propagation de bactéries résistantes.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (IQ biotechnologie plate-forme, Infection de médecine, Université de Lund) est reconnu pour l’exécution et en fournissant des photographies au microscope électronique de balayage. Ce travail a été soutenu par des subventions de la suédoise recherche Conseil Formas (2017-00100) dans le cadre de l’Initiative troisième européen de programmation conjointe à l’appel, la résistance aux antimicrobiens (JPIAMR) « Dynamique de la Transmission. » Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, de l’interprétation, écriture préparation du manuscrit, décision à soumettre, ou la décision de publier les travaux.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |