Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem
Summary
Çevre zenginleştirme (EE) yaşam tarzı, stres ve hastalık arasındaki bağlantıları altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılan bir hayvan konut ortamdır. Bu iletişim kuralı özellikle hayvan mortalite etkisi olabilir microbiota biyolojik çeşitlilik değişiklikleri tanımlamak için iki nokta üst üste tumorigenesis ve EE bir fare modelini kullanan bir yordam açıklanır.
Abstract
Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda insan hastalık geliştirmeye yönelik an enriched çevre yaşayan yararlı etkileri gösterildiği. Farelerde, çevre zenginleştirme (EE) fare bağışıklık sistemini harekete geçirerek tumorigenesis azaltır veya geliştirilmiş microbiome çeşitlilik, tümör microenvironment dahil yara onarım yanıt uyararak tümörü taşıyan hayvan hayatta kalma etkiler. Burada olması koşuluyla bir fare kolon tümörü modelindeki microbiome çevre zenginleştirme biyoçeşitlilik üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ayrıntılı bir yönerge. Hayvancılık ve hayvan genotip ve fare koloni entegrasyonu için konuları ile ilgili önlemler açıklanmıştır, tümü sonuçta mikrobiyal biyolojik çeşitlilik etkiler. Bu önlemler heeding daha fazla tek tip microbiome aktarımına izin vermek ve sonuç olarak çalışma bulguları yıkmak tedavi olmayan bağımlı etkileri hafifletmek. Ayrıca, bu yordam, 16S rDNA sıralama gelen uzun vadeli çevre zenginleştirme takip distal kolon toplanan dışkı izole DNA kullanarak microbiota değişiklikleri karakterizedir. Gut microbiota dengesizlik iltihabi bağırsak hastalığı ve kolon kanseri, aynı zamanda obezite ve diyabet diğerleri arasında patogenezi ile ilişkilidir. Önemlisi, bu iletişim kuralı için EE ve microbiome analiz microbiome patogenezinde rol insan hastalık özetlemek nerede sağlam fare modelleri mevcut hastalıkların çeşitli eğitim için yararlı olabilir.
Introduction
Çevre zenginleştirme (EE) çalışmalar sosyal stimülasyon (büyük konut kafesleri, hayvanların büyük gruplar), bilişsel stimülasyon (kulübe, tünel, iç içe geçmiş malzeme, platformlar) ve fiziksel aktivite (koşularda etkiler için karmaşık konut parametrelerini kullanmak tekerlekler). EE hastalığı başlatma ve fare modelleri, berberlik indüklenen alopesi, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere geniş bir dizi kullanarak ilerleme artmış aktivite ve geliştirilmiş sosyal ve Bilişsel etkileşimleri etkileri anlamak için birçok labs tarafından kullanıldığında vardır, Rett sendromu ve birkaç tümör ve sindirim rahatsızlıkları modelleri1,2,3,4,5,6.
Birkaç fare modelleri iki nokta üstüste tumorigenesis farelerde incelemek için geliştirilmiştir. Belki de en iyi tanımlanmış modeli ApcMin faredir. ApcMin fare 19907William Dove laboratuvarda geliştirilen ve yaygın olarak insan kolorektal kanseri ile ilişkili APC gen mutasyonlar bir fare modeli olarak kullanılmıştır. Aksine insanlar öncelikle APC mutasyonlar, ApcMin fareler barındıran küçük bağırsak tümörleri, kolon tümörleri çok nadir görülmesi ile geliştirmek. Ancak, bir Tcf4Het alleli Tcf4, bir tek knockin nakavt heterozigoz mutasyon ile büyük ölçüde ApcMin alleli8ile birleştirildiğinde iki nokta üstüste tumorigenesis artırır. Son zamanlarda, bu fare modeli kolon tumorigenesis kolon tumorigenesis6EE etkilerini belirlemek için kullanılır. İçinde Bice ve ark. çalışma, fizyolojik ve fenotipik EE üzerine etkileri kadın ve erkek dört farklı fare satırlarının (vahşi-tipi (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + ApcMin / +, ve Tcf4 Het / + APCMin / +)) tanımlı değil. Belki de en ilginç bulgu EE önemli ölçüde hem erkek hem de dişi kolon tümörü taşıyan hayvanların ömrü artar oldu. Bu EE en az azaltabilir gösterdi bazı belirtilerin iki nokta üstüste tumorigenesis ile ilişkili ve hayvan sağlığını geliştirmek. Dikkat çekici, erkeklerde geliştirilmiş bu ömrü sınırlı tumorigenesis doğrudan bir sonucu değildir ve bunun yerine yanıt geliştirilmiş microbiome biyolojik çeşitlilik6dahil olmak üzere, şifa bir tümör yara inisiyasyon bağlıydı.
Birkaç EE belirli çalışmaları ile ilginç sonuçları yayınlanmıştır. Ancak, bir teknik açıdan önemli sonuçlar diğer laboratuvarlar için çevrilebilir değildir. Aynı EE metodolojileri farklı laboratuvarlar arasında Bakımı olan bir inanılmaz derecede karmaşık bir sorun, sadece zenginleştirme aygıtlar ve kullanılan, konut nedeniyle ama aynı zamanda yatak takımları, gıda, havalandırma, üreme, genetik, etkinlik oda ve hayvan iletişim kuralı gereksinimleri, diğerleri arasında9,10,11. Bir hayvan Tümleştirme, nerede hayvanlar stabil fare koloni, bu nedenle genetik arka plan ve diyet kompozisyon tedavi sigara ilgili etkileri önlemek için normalleştirme tümleştirilmelidir örnektir. Ayrıca, birçok EE çalışma microbiome hastalığı ve ortak fare yetiştiriciliği uygulamaları gut microbiome10,12bileşimi etkileyebilir yol önemi gerçekleşme öncesinde tamamlanmıştır.
EE üreme stratejisi ve hayvan yerleştirme-stres artırabilir değilse düzgün gerçekleştirilen. EE çalışmalar çok sayıda erkek ve dişi hayvanlar ve birden çok genotip kullanmak beri deneysel hayvan gereksinimini birleştirilmek üzere birkaç çöp verilen zor kurulabilir. Bu nedenle, bir üreme ve strateji Sütten kesme geliştirilmiştir farklı çöp üzerinden doğru genotip Emzikteki hayvanların birleştirme izin vermek için. Bunun için birincil mantığı çöp arasında microbiota normalize etmek ve deneysel çevreye hayvanlar taşındığında stresi azaltmak için yapıldı. Microbiome Barajı10‘ dan gönderilmiş. Kolonisi mikrobiyal çeşitliliği sağlamak için kadın Jackson Labs satın alınan ve bir ay önce9,10,12deneme başladı koloni entegre. Daha fazla microbiome biyolojik çeşitlilik hayvanlar arasında normalize etmek, kadın üreme önce co barındırılıyor. Islahı, yetiştirme sırasında ortak konut ve kaçmak için yetenek Hemşirelik pups stres düzeyleri anne bakım13,14muhtemelen microbiome normalleştirme sürdürmek, geliştirilmiş. EE sigara önlemek için microbiome üzerindeki etkileri ile ilgili, tüm deneysel hayvan bu ortak konut bir deneysel kafes içine farklı çöp üzerinden birkaç erkek birleştirirken oluştu mücadele ve ek stres engelledi. Son olarak, tüm genotip hayvanların eşit sayıda kafeslerde dahil edilmiştir. Bu geliştirilmiş microbiota biyolojik çeşitlilik için fırsat genotip arasında sağlanan ve coprophagia (dışkı tüketmeye hayvanın eğilim) veya olası genotip özgü davranış farklılıkları genel bir çalışma. kaldırıldı
Bu iletişim kuralı microbiome araştırma, daha fazla tek tip microbiome nüfus etkinleştirmek için microbiota normalleştirme microbiota iletim ve hayvan koloni Tümleştirme dahil olmak üzere bilinen yönleri dahil etmek için önceki EE çalışmalarda genişletir bir strateji sağlar deneysel hayvan arasında. Bu önlemler heeding çalışma bulguları yıkmak yeteneği olmayan tedavi ilgili microbiota farklılıklar nedeniyle önemlidir. EE sigara ortadan kaldırarak microbiota değişiklikleri araştırmacılar özellikle microbiota kompozisyon hastalığı gelişme ve ilerleme sırasında EE rolü tanımlamak sağlayacaktır ilgili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yordam, normal veya tümör hayvan taşıyan çevre zenginleştirme takip dışkı izole microbiota analizi için verir. Çünkü bunlar farklı cinsiyette ve genotip birçok hayvan elde etmek üreme dahil büyük deneyler, microbiome deney başlamasından önce hayvanlar arasında normalleştirme önemlidir sigara-EE önlemek için microbiome üzerindeki etkileri ile ilgili biyolojik çeşitlilik.
NE ve EE koşullar arasında tutarlılık sağlamak için üreme süreci tüm fareler başlan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B. Dalley’in Utah Üniversitesi Biyoistatistik temel istatistik tavsiye ve erişim için Ulusal Kanser Enstitüsü Ödülü P30 CA042014 tarafından desteklenen bu teknik çekirdek Utah Üniversitesi genomik çekirdek Kütüphane sıralama ve K. Boucher için teşekkür ediyoruz. Açıklanan proje Ulusal Kanser Enstitüsü hibe P01 CA073992 ve K01 CA128891 ve avcı kanser Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
