Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse
Summary
Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.
Abstract
Vários estudos recentes ilustraram os efeitos benéficos de viver em um ambiente enriquecido em melhorar a doença humana. Em camundongos, enriquecimento ambiental (EE) reduz a tumorigênese ativando o sistema imunológico do mouse, ou afeta a sobrevivência animal do tumor rolamento, estimulando a resposta de reparação de ferida, incluindo diversidade microbiome melhorada, no microambiente do tumor. Desde que aqui é um procedimento detalhado para avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade da microbiome em um modelo de tumor de cólon do rato. Precauções em matéria de criação de animais e considerações para integração de colônia de genótipo e mouse animal são descritas, que acabará por afectar a biodiversidade microbiana. Atendendo a estas precauções pode permitir a transmissão de microbiome uniforme mais e consequentemente irá aliviar efeitos dependentes do não-tratamento que podem confundir as conclusões do estudo. Além disso, neste procedimento, as alterações da microbiota são caracterizadas usando 16S rDNA de sequenciamento de DNA isolado de fezes coletadas de cólon distal após enriquecimento ambiental a longo prazo. Desequilíbrio de microbiota do intestino está associado com a patogênese da doença e cólon câncer de inflamação intestinal, mas também de obesidade e diabetes entre outros. Importante, este protocolo para análise EE e microbiome pode ser utilizado para estudar o papel da patogênese microbiome através de uma variedade de doenças onde existem modelos de rato robusto que pode recapitular a doença humana.
Introduction
Estudos de enriquecimento ambiental (EE) utilizam parâmetros de complexo habitacional para afetar a estimulação social (habitação grandes gaiolas, grandes grupos de animais), estimulação cognitiva (cabanas, túneis, materiais de nidificação, plataformas) e atividade física (correr rodas). EE tem sido utilizada por muitos laboratórios para compreender os efeitos da atividade aumentada e melhorada de interações sociais e cognitivas na doença início e progressão usando uma ampla gama de modelos do rato, incluindo a alopécia induzida barbeiro, a doença de Alzheimer, Síndrome de Rett e doença tumoral e digestivo vários modelos1,2,3,4,5,6.
Vários modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar a tumorigênese de cólon em ratos. Talvez o modelo mais bem definido é o mouse ApcMin . O mouse ApcMin foi desenvolvido no laboratório de William pomba em 19907e tem sido usado como um modelo do rato de mutações no gene APC que são comumente associados com câncer colorretal humano. Em contraste com os humanos abrigando mutações do APC , ApcMin ratos principalmente desenvolvem pequenos tumores intestinais, com ocorrência muito rara de tumores de cólon. No entanto, um alelo Tcf4Het com uma única mutação heterozigoto knockin-nocaute em Tcf4, aumenta vastamente tumorigênese cólon quando combinado com o alelo de ApcMin 8. Recentemente, este modelo de rato da tumorigênese cólon serviu para determinar os efeitos de EE no cólon tumorigênese6. No Bice et al. estudar, os efeitos fisiológicos e fenotípicos de EE nos machos e nas fêmeas de quatro linhas de mouse diferente (tipo selvagem (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + ApcMin / +, e Tcf4 Het / + APCMin / +)) foram definidos. Talvez a descoberta mais interessante foi que EE aumenta significativamente a vida útil dos animais de rolamento de tumor de cólon tanto masculinos como femininos. Isto demonstrou que EE pode reduzir pelo menos alguns dos sintomas associados a tumorigênese do cólon e melhorar a saúde animal. Notavelmente, este prazo de vida melhorado nos machos não é um resultado direto da tumorigênese reduzido e em vez disso, estava relacionado com o início de uma resposta, incluindo melhoria microbiome biodiversidade6de cicatrização de feridas de tumor.
Vários estudos específicos de EE têm sido publicados com resultados interessantes. No entanto, do ponto de vista técnica, importantes resultados muitas vezes não são traduzíveis para outros laboratórios. Manutenção de metodologias EE idênticas entre diferentes laboratórios é um incrivelmente complexa, não só devido a dispositivos de enriquecimento e habitação usada, mas também roupa de cama, comida, ventilação, reprodução, genética, atividade em sala e do protocolo de animais requisitos, entre outros9,10,11. Um exemplo é a integração de animais, onde os animais devem ser estàvel integrados a colônia de rato, portanto normalizando a composição genética da dieta e plano de fundo, para evitar efeitos relacionados não-tratamento. Além disso, muitos estudos EE foram concluídos antes da realização da importância da microbiome na doença e a maneira que práticas de maneio comuns do mouse podem afetar a composição do intestino microbiome10,12.
Colocação de estratégia e animal de criação em EE pode aumentar o estresse se não for executado corretamente. Desde que estudos EE utilizam grandes números de animais machos e fêmeas e vários genótipos, instalação experimental pode ser difícil dada a exigência de animais de várias ninhadas para ser combinado. Portanto, uma criação e estratégia de desmame foi desenvolvido para permitir a combinação de animais desmamados com o genótipo de correto de ninhadas diferentes. A principal justificativa para isso foi para normalizar a microbiota entre ninhadas e reduzir o estresse, quando os animais foram transferidos para o ambiente experimental. A microbiome foi transmitido do dam10. Para fornecer diversidade microbiana para a colônia, fêmeas foram adquiridas de laboratórios de Jackson e integradas a colônia por um mês antes do início do experimento de10,9,12. Para normalizar mais microbiome biodiversidade entre os animais, as fêmeas foram co alojadas antes da reprodução. Após a criação, habitação comunal durante a criação e a capacidade de escape enfermagem filhotes melhoraram os níveis de estresse de cuidados maternos13,14, possivelmente promover microbiome normalização. Para evitar a não-EE relacionados com efeitos sobre a microbiome, esta habitação comunal de todos os animais experimentais impediu estresse adicional e luta que ocorreu quando combinando vários machos de ninhadas diferentes em uma gaiola experimental. Finalmente, um número igual de animais de todos os genótipos foram incluído nas gaiolas. Isto forneceu a oportunidade para a biodiversidade da microbiota melhorada através de genótipos e removido a contribuição de coprofagia (tendência do animal para consumir fezes) ou possíveis diferenças comportamentais de genótipo específico para o estudo global.
Este protocolo fornece uma estratégia que expande os estudos anteriores EE para incluir aspectos conhecidos de microbiome pesquisa, incluindo integração de colônia transmissão e animal microbiota para normalização da microbiota, para permitir mais uniforme microbiome populações entre animais experimentais. Atendendo a estas precauções é essencial devido à capacidade de não-tratamento relacionados microbiota diferenças para confundir as conclusões do estudo. Eliminação não-EE relacionadas com alterações da microbiota permitirá aos pesquisadores definir especificamente o papel do EE na composição da microbiota durante o desenvolvimento da doença e a progressão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento permite a análise da microbiota isolado de fezes de enriquecimento ambiental de normal ou tumor rolamento animais a seguir. Porque estas são as grandes experiências que envolvem a reprodução para obter muitos animais de sexos diferentes e de genótipos, normalizar o microbiome entre animais antes do início do experimento é essencial evitar a não-EE relacionados com efeitos na microbiome biodiversidade.
Para consistência entre condições NE e EE, o processo de criaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos B. Dalley no núcleo genómica da Universidade de Utah para sequenciamento de biblioteca e K. Boucher no núcleo para conselhos de estatístico e acesso a estes núcleos técnicos suportado pelo prêmio do National Cancer Institute P30 CA042014 Bioestatística da Universidade de Utah. O projeto descrito foi apoiado pelo National câncer Institute subsídios P01 CA073992 e K01 CA128891 e o Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
