Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren
Summary
Environmental Enrichment (EE) ist eine Unterbringung von Tieren, die verwendet wird, um Mechanismen zu offenbaren, die die Zusammenhänge zwischen Lebensstil, Stress und Krankheit zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, das verwendet ein Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese und EE speziell Veränderungen in Mikrobiota Artenvielfalt definieren, die tierischen Sterblichkeit auswirken können.
Abstract
Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass die positiven Auswirkungen des Lebens in einer angereicherten Umgebung auf die Verbesserung der menschlichen Krankheit. Bei Mäusen Umweltanreicherung (EE) reduziert Tumorgenese durch die Aktivierung des Immunsystems Maus oder Tumor tragenden Tiere überleben durch die Stimulierung der Wunde Reparatur Reaktion, einschließlich der verbesserten Microbiome Vielfalt in der Mikroumgebung Tumor betrifft. Hier liegt ein detailliertes Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen von Umweltanreicherung auf die Biodiversität des Mikrobiom in einem Mausmodell für Darm-Tumor. Vorsichtsmaßnahmen bezüglich Tierzucht und Überlegungen für die Tier-Genotyp und Maus-Kolonie-Integration werden beschrieben, die letztendlich auf mikrobielle Artenvielfalt auswirken. Diese Vorsichtsmaßnahmen beachtet kann mehr einheitliche Microbiome Übertragung, und folglich wird lindern Nichtbehandlung abhängige Effekte, die Studienergebnisse verwirren können. Weitere, in diesem Verfahren Mikrobiota Änderungen sind mit 16 s rDNA Sequenzierung der DNA isoliert vom Hocker, gesammelt aus dem distalen Dickdarm nach langfristigen Umweltanreicherung charakterisiert. Darm Microbiota Ungleichgewicht ist verbunden mit der Entstehung von entzündlichen Darm-Krankheit und Darmkrebs, aber auch von Fettleibigkeit und Diabetes unter anderem. Wichtig ist, kann dieses Protokoll für EE und Mikrobiom Analyse genutzt werden, um die Untersuchung der Rolle von Microbiome Pathogenese über eine Vielzahl von Krankheiten, wo robuste Mausmodelle existieren, die menschliche Krankheit rekapitulieren kann.
Introduction
Umweltanreicherung (EE) Studien nutzen komplexe Gehäuse Parameter um soziale Stimulation (großes Gehäuse Käfige, größere Gruppen von Tieren), kognitive Stimulation (Hütten, Tunnel, Verschachtelung Materialien, Plattformen) und körperliche Aktivität (laufen zu beeinflussen Räder). EE ist durch viele Labore zu verstehen, die Auswirkungen der erhöhten Aktivität und verbesserte soziale und kognitive Interaktionen auf Krankheit Initiation und Progression mit einer Vielzahl von Mausmodellen, einschließlich Barbe induzierte Alopezie, Alzheimer-Krankheit verwendet worden, Rett-Syndrom und mehrere Tumor und Magen-Darm-Krankheit-Modelle1,2,3,4,5,6.
Mehrere Maus-Modelle wurden entwickelt, um Doppelpunkt Tumorgenese bei Mäusen zu studieren. Vielleicht ist das am meisten klar definierte Modell der ApcMin -Maus. Die Apc-Min -Maus wurde im Labor von William Dove in 19907entwickelt und wird als ein Maus-Modell der Mutationen im APC -gen, die häufig im Zusammenhang mit menschlichen colorectal Krebs sind. Im Gegensatz zu Menschen beherbergen APC Mutationen entwickeln ApcMin Mäuse in erster Linie kleinen Darmtumoren mit sehr seltenen Auftreten von Dickdarm-Tumoren. Ein Tcf4Het Allel mit einer einzigen Profi-Ko heterozygote Mutation im Tcf4, erhöht jedoch erheblich Doppelpunkt Tumorgenese in Kombination mit dem ApcMin -Allel-8. Vor kurzem wurde diese Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese Ermittlung die Auswirkungen von EE auf Doppelpunkt Tumorgenese6eingesetzt. Im Bice Et Al. studieren, die physiologischen und phänotypischen Auswirkungen von EE auf Männchen und Weibchen von vier verschiedenen Mauslinien (Wildtyp (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ / + ApcMin / +, und Tcf4 Het / + APCMin / +)) definiert wurden. Vielleicht war die interessanteste Erkenntnis, dass EE wesentlich die Lebensdauer der männlichen und weiblichen Doppelpunkt Tumor-tragenden Tieren erhöht. Dies zeigte, dass EE zumindest reduzieren kann einige der Symptome verbunden mit Doppelpunkt Tumorgenese und Verbesserung der Tiergesundheit. Bemerkenswert ist, diese verbesserte Lebensdauer bei Männern ist keine direkte Folge der reduzierten Tumorgenese und stattdessen auf die Einleitung einer Tumor-Wundheilung Reaktion, einschließlich verbesserte Microbiome Biodiversität6verknüpft war.
Mehreren EE spezifische Studien wurden mit interessanten Ergebnissen veröffentlicht. Aus technischer Sicht sind wichtige Ergebnisse oft nicht übersetzbar an andere Laboratorien. Identische EE Methoden zwischen verschiedenen Labors ist ein unglaublich komplexes Thema, nicht nur wegen Bereicherung Geräte und Gehäuse eingesetzt, aber auch Bettwäsche, Essen, Belüftung, Zucht, Genetik, Aktivität in den Raum, und Tier-Protokoll Anforderungen, unter anderem9,10,11. Ein Beispiel ist Tier Integration, wo müssen Tiere stabil in der Kolonie Maus integriert werden daher Normalisierung der genetische Hintergrund und Ernährung Zusammensetzung, um verwandte Behandlungseffekte zu vermeiden. Weitere, viele EE-Studien vor der Realisierung der Bedeutung des Mikrobiom in Krankheit und die Art und Weise, dass gemeinsame Maus Haltungspraktiken können Einfluss auf die Zusammensetzung der Darm Microbiome10,12abgeschlossen wurden.
Zucht-Strategie und Tier Platzierung in EE kann Stress erhöhen, wenn Sie nicht korrekt ausgeführt. Da EE Studien viele männliche und weibliche Tiere und mehrere Genotypen nutzen, kann Versuchsaufbau schwierig sein angesichts der Forderung für Tiere aus mehreren Würfen kombiniert werden. Daher wurde eine Zucht und Entwöhnung Strategie entwickelt, damit für die Kombination der entwöhnte Tiere von der richtigen Genotyp aus verschiedenen Würfen. Der primäre Grund dafür war die Mikrobiota unter Würfe zu normalisieren und Stress zu reduzieren, wenn Tiere in die experimentelle Umgebung verschoben wurden. Das Mikrobiom wurde aus dem Damm10übertragen. Um mikrobielle Vielfalt in die Kolonie zu bieten, wurden Weibchen von Jackson Labs gekauft und in die Kolonie für einen Monat vor Beginn des Experiments9,10,12integriert. Um weitere Microbiome Biodiversität zwischen Tieren zu normalisieren, waren Frauen vor der Zucht zusammen untergebracht. Nach Zucht, kommunale Wohnraum während der Aufzucht und die Fähigkeit, entkommen verbesserte Pflege Welpen den Stress der mütterlichen Fürsorge13,14, eventuell Förderung Microbiome Normalisierung. Um zu verhindern, dass nicht-EE im Zusammenhang mit Auswirkungen auf das Mikrobiom, dieses kommunale Gehäuse alle Versuchstiere verhindert kämpfen und zusätzliche Stress, die aufgetreten sind, wenn mehrere Männchen aus verschiedenen Würfen in einem experimentellen Käfig kombiniert. Zu guter Letzt wurden paritätisch von Tieren alle Genotypen in den Käfigen. Dies bot die Gelegenheit für verbesserte Mikrobiota Biodiversität über Genotypen und entfernt den Beitrag der Koprophagie (das Tier tendenziell Hocker verbrauchen) oder möglichen Genotyp-spezifische Verhaltensunterschiede der gesamten Studie.
Dieses Protokoll sieht eine Strategie, die EE Vorgängerstudien um unbekannte Aspekte des Mikrobiom Forschung, einschließlich Mikrobiota Übertragungs- und Tier Kolonie Integration für Mikrobiota Normalisierung ermöglichen mehr einheitliche Microbiome Populationen erweitert erweitert zwischen den Versuchstieren. Beherzigen diese Vorsichtsmaßnahmen unbedingt aufgrund der Fähigkeit von Nichtbehandlung Verwandte Mikrobiota Unterschiede um Studienergebnisse zu verwirren. Beseitigung von nicht-EE bezogene Mikrobiota Änderungen, speziell die Rolle von EE auf Mikrobiota Zusammensetzung während der Entwicklung der Krankheit und das Fortschreiten definieren erlauben werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse der Mikrobiota isoliert vom Hocker nach Umweltanreicherung Normal oder Tumor mit Tieren. Da das große Experimente die Zucht sind um viele Tiere unterschiedlichen Geschlechts und Genotypen zu erhalten einbeziehen, Normalisierung der Microbiome zwischen Tieren vor Beginn des Experiments ist wichtig im Zusammenhang mit nicht-EE zu vermeiden Auswirkungen auf Microbiome biologische Vielfalt.
Aus Gründen der Kohärenz zwischen NE und EE Bedingungen wird Zuc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken B. Dalley in der University of Utah Genomik-Kern für Bibliothek Sequenzierung und K. Boucher in der University of Utah Biostatistik-Kern für statistische Beratung und Zugang zu diesen technischen Kerne vom National Cancer Institute Award P30 CA042014 unterstützt. Das beschriebene Projekt wurde von der National Cancer Institut Zuschüsse P01 CA073992 und K01 CA128891 und Huntsman Cancer Foundation unterstützt.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
